英文标题：Integrated serum pharmacochemistry-guided evaluation of Diyu Huanglian San against ethanol-induced gastric injury: involvement of kaempferol and PI3K/AKT signaling

中文标题：基于血清药物化学整合指导的地榆黄连散抗乙醇致胃损伤作用评价：山奈酚与PI3K/AKT信号通路的参与

发表期刊：Journal of Ethnopharmacology

影响因子：6.8

研究背景

胃溃疡是全球高发消化系统疾病，过量饮酒是诱发急性胃黏膜损伤重要外因。高浓度乙醇可直接破坏胃黏膜黏液保护屏障，引发化学性损伤，伴随氧化应激失衡、炎症浸润，最终造成上皮细胞大量凋亡。目前，临床多采用质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂等抑酸药物进行干预，虽可快速缓解症状，但长期用药易诱发肠道菌群紊乱、骨折风险升高等不良反应，因此从天然中药中发掘安全有效的胃黏膜保护药物成为研究热点。地榆黄连散(Diyu Huanglian San, DYHLS)载于《太平圣惠方》，由地榆、黄连、木香、当归配伍而成，诸药配伍可发挥止血清热、行气活血、促进黏膜修复等功效。然而，中药复方药效物质基础尚不明晰，体外高含量成分未必能有效吸收入血。血清药物化学可精准筛选入血活性成分，现有研究证实PI3K/AKT信号通路能够调控胃黏膜细胞存活与损伤修复。据此，本研究构建乙醇诱导小鼠急性胃损伤模型，运用血清药物化学联合UPLC-MS技术识别DYHLS入血活性成分，旨在系统揭示该中药复方对乙醇诱导急性胃黏膜损伤的保护效应及其通过PI3K/AKT通路发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡作用的分子机制。

研究结果

01.DYHLS对乙醇诱导小鼠胃黏膜损伤具有显著保护作用

首先，通过整体动物药效实验，研究证实DYHLS对乙醇诱导小鼠急性胃黏膜损伤具有显著保护效应，其功效如下：①能够剂量依赖性缩减出血溃疡范围，稳定胃黏膜形态（图1A）；②显著下调溃疡指数，且高剂量组的胃保护率接近80%（图1B-C）；③给予DYHLS干预后，乙醇刺激导致的炎症介质（图1D-G）释放及氧化失衡状态（图1H-1J）均被有效改善，并且中、高剂量作用优势突出；④经DYHLS治疗后的病理损伤得到有效恢复，高剂量组黏膜结构基本完整，炎症浸润大幅减少，组织形态趋近正常小鼠（图1K）。因此，DYHLS通过强效的抗炎与抗氧化机制，有效预防和改善了乙醇诱导的小鼠急性胃黏膜损伤。

图1.地榆黄连散对乙醇诱导小鼠胃黏膜损伤的保护作用及其抗炎、抗氧化应激机制研究

02.UPLC-MS分析鉴定地榆黄连散入血活性成分

为阐明DYHLS治疗胃黏膜损伤的药效物质基础，研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术，在正、负离子模式下分别对DYHLS提取物及小鼠口服给药后的含药血清进行了全面分析，三者基峰色谱图结果详见图2。依据质谱响应强度，丰度最高的30种化合物被筛选鉴定，主要包括原小檗碱类生物碱和酚酸类化合物，构成了DYHLS的特征化学谱。在此基础上，通过比对质谱数据及二次筛选，最终鉴定出24种具有潜在药理活性的真实入血成分（表1），它们构成了DYHLS发挥系统性和靶向性黏膜保护作用的物质基础，可作为候选成分用于后续研究。

图2.基于UPLC-MS/MS技术的地榆黄连散血清药物化学分析

表1.DYHLS的入血成分

03.基于网络药理学与分子对接解析DYHLS防治胃黏膜损伤潜在机制

基于上述24种活性成分，研究采用网络药理学策略，拟进一步挖掘DYHLS的潜在作用机制。首先，通过韦恩图共获得83个疾病交集靶点（图3A）。随后，将这些靶点导入STRING数据库构建PPI网络（图3B），根据拓扑分析，AKT1、EGFR、SRC等节点度值较高被确定为DYHLS发挥黏膜保护作用的核心基因。结合GO与KEGG富集分析，这些靶点显著富集于PI3K-AKT信号通路、雌激素通路等，其中PI3K-AKT通路富集程度最为突出（图3C-F）。值得注意的是，PI3K-AKT与AKT1、PIK3R1等关键靶点存在强映射关系，暗示该通路的调控可能是DYHLS黏膜保护作用的核心机制（图3E）。进一步构建“活性成分-交集靶点”网络（图3G）并统计各成分的靶点度值（图3I）。结果显示，山奈酚(Kaempferol)关联靶点最多，是DYHLS中最关键的药效物质基础；皂皮酸和科里索酸等成分也做出了重要贡献。分子对接分析中，大多数成分与核心靶点（AKT1、PIK3CA、BCL2、BAX等）有着良好的结合活性（图3H）。山奈酚与PI3K和AKT的三维对接构象（图3J-K）显示，其能深入靶蛋白活性位点，通过氢键与关键氨基酸残基形成稳定相互作用。综上，DYHLS依靠多成分、多靶点起效，其中山奈酚连通性与成药性最优，可选为后续细胞与动物实验验证标志物；同时，复方整体疗效源于多种化学成分协同作用，不能简单归因于单一活性成分。

图3.DYHLS干预胃黏膜损伤的网络药理学及分子对接分析

04.DYHLS通过激活PI3K/AKT信号通路抑制胃黏膜细胞凋亡

前文已知，PI3K-AKT信号通路与细胞凋亡在DYHLS的黏膜保护作用中占据核心地位。为验证这一机制，研究首先采用Western blotting检测了各组胃组织中相关蛋白的表达水平（图4A）：与对照组相比，模型组胃组织中PI3K和AKT的磷酸化水平均显著降低，表明胃黏膜损伤状态下促生存信号通路被严重抑制；而DYHLS各剂量组处理则剂量依赖性地逆转了这一抑制，显著上调PI3K和AKT的磷酸化水平（图4B-C）。随后，PI3K/AKT通路下游凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达被检测：同样地，DYHLS治疗也呈剂量依赖性地上调了Bcl-2/Bax比值，显著改善二者表达失衡，说明其具有较强的抗凋亡潜力（图4D）。组织学水平上，结合TUNEL荧光染色，DYHLS各剂量组均显著减少了TUNEL阳性细胞的数量和面积，改善了凋亡变化（图4E-F）。以上蛋白分子与组织学证据相互印证，表明DYHLS能够激活PI3K/AKT信号通路，调控Bcl-2与Bax表达平衡，进而抑制胃黏膜上皮细胞凋亡，缓解乙醇刺激造成的胃黏膜损伤。

图4.DYHLS通过激活PI3K/AKT 信号通路抑制胃黏膜损伤诱导的细胞凋亡

05.体外验证代表性入血标志物对乙醇诱导GES-1细胞损伤的保护作用

为进一步解析DYHLS对乙醇损伤GES-1胃黏膜上皮细胞的保护机制，研究选取核心成分“山奈酚”展开体外功能验证。经乙醇造模与山奈酚治疗浓度的确定后（图5A-B），结果显示：山奈酚预处理后细胞活力显著且呈剂量依赖性恢复，高剂量组的保护效果与阳性对照药奥美拉唑相当，证实了山奈酚对乙醇诱导GES-1细胞损伤的保护作用（图5C）。此外，乙醇刺激导致GES-1细胞的促炎反应（TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达升高）能够被山奈酚显著且呈剂量依赖性地抑制（图5D-F），进一步表明山奈酚可通过缓解乙醇刺激引发的炎症反应来保护胃黏膜细胞。Western blot结果也与体内实验验证相一致：乙醇刺激显著抑制了GES-1细胞中PI3K和AKT的磷酸化水平（图5H-I），并导致Bcl-2/Bax比值显著下降（图5J）；而山奈酚处理，尤其是高剂量组，能有效逆转了上述病理变化。综上，山奈酚作为DYHLS的核心活性成分，能够通过抑制炎症反应、激活PI3K/AKT信号通路并恢复Bcl-2/Bax平衡，直接保护胃黏膜上皮细胞免受乙醇损伤。

图5.代表性入血活性成分通过抑制炎症并激活PI3K/AKT通路缓解乙醇诱导的GES-1细胞损伤

06.分子动力学模拟验证活性探针与核心靶点稳定结合

研究构建山奈酚-PI3K、山奈酚-AKT复合物开展100 ns分子动力学模拟。山奈酚与PI3K模拟结果见图6：复合物RMSD快速达到平衡，蛋白骨架维持稳定（图6A）；Rg、SASA（图6B-C）与RMSF（图6D）数据证实蛋白构象紧凑，配体结合不会引发蛋白结构剧烈波动。模拟期间二者持续形成多条氢键（图6E），结合自由能显示亲和力优异（图6F）；自由能地貌图显示复合物最终稳定在优势低能构象（图6G-H），三维结构图可见山奈酚在PI3K口袋内形成稳定氢键网络（图6I）。综上，山奈酚能够自发、高亲和力稳定结合PI3K、AKT蛋白活性口袋，这为DYHLS代表性活性成分“山奈酚”激活PI3K/AKT信号通路提供直接分子机制证据。

山奈酚-AKT复合物模拟结果见图7：体系RMSD、Rg、SASA整体波动极小（图7A-C），结合区域柔性低（图7D）。山奈酚可与AKT形成最多6条氢键（图7E），结合自由能水平体现强效相互作用（图7F）；自由能地貌图证实复合物具备良好热力学稳定性（图7G-H），其可与AKT催化域关键氨基酸残基形成氢键（图7I）。

图6.100纳秒分子动力学模拟过程中山奈酚-PI3K复合物的动态稳定性

图7.100纳秒分子动力学模拟过程中山奈酚-AKT复合物的动态稳定性

07.预测活性化合物山奈酚在体内改善胃黏膜损伤的验证

为验证网络药理学预测的PI3K/AKT通路激活效应，研究以山奈酚作为机制探针，设定50、100和200 mg/kg三个剂量进行体内验证实验，其核心结果如下：①山奈酚可剂量依赖性改善胃黏膜病变、缩小溃疡面积（图8A）；②能够稳定溃疡损伤程度，且高剂量山奈酚（200 mg/kg）胃保护率可达80%以上，疗效与阳性药奥美拉唑相近（图8B-C）；③有效修复胃黏膜组织结构、减轻炎性浸润（图8K）；④呈剂量依赖性抑制炎症释放（图8D-8G）、恢复抗氧化能力（图8H-J）。这也就表明，山奈酚同样可通过抗炎、抗氧化显著改善乙醇诱导的小鼠胃黏膜损伤，证实其为DYHLS的核心药效活性成分。

图8.代表性活性标志物山奈酚改善乙醇诱导胃黏膜损伤的体内验证

08.体内验证核心活性成分对PI3K/AKT信号通路的激活作用

再次聚焦核心成分山奈酚，研究通过检测小鼠胃组织中PI3K/AKT通路及凋亡相关蛋白表达，并原位评估胃黏膜细胞凋亡水平，山奈酚保护胃黏膜的分子机制被进一步揭示，其结果与体外细胞实验结论高度一致：当给予不同剂量山奈酚干预后，模型鼠的PI3K、AKT蛋白磷酸化水平、Bcl-2/Bax比值等异常指标均呈剂量依赖性被显著逆转，胃黏膜损伤得到有效恢复，凋亡通路的激活被显著抑制（图9A-D）。此外，TUNEL荧光染色显示，随着山奈酚给药剂量升高，胃组织荧光阳性信号明显减弱，由乙醇可诱发严重的胃黏膜上皮细胞凋亡被有效改善，且高剂量组细胞凋亡水平基本恢复正常（图9E-F）。简言之，体内机制实验与体外实验、网络药理学预测结果相互印证，证实DYHLS核心活性成分山奈酚可通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制乙醇诱导的胃黏膜细胞凋亡，最终发挥显著的胃黏膜保护作用。

图9.活性探针在体内通过激活PI3K/AKT通路抑制乙醇诱导的小鼠胃黏膜细胞凋亡

研究总结

本研究以经典中药复方DYHLS为研究对象，针对酒精诱发急性胃黏膜损伤展开系统机制探究，首先通过小鼠体内药效实验证实DYHLS可呈剂量依赖性减轻胃组织出血溃疡，其功效与抑制炎症、恢复抗氧化能力及修复黏膜病理损伤相关；采用UPLC-Q-TOF-MS血清药物化学技术对比复方原液与含药血清，筛选得到24种体内入血活性成分，其中“山奈酚”网络关联度最高；依托网络药理学预测并结合分子对接、100 ns分子动力学模拟证实山奈酚可稳定结合PI3K、AKT蛋白活性口袋，PI3K/AKT通路是复方护胃核心调控轴；随后分别开展GES-1胃上皮细胞体外实验、山奈酚单体动物体内验证，从细胞活力、炎症基因、通路凋亡蛋白、TUNEL凋亡染色多个维度印证，山奈酚可通过激活PI3K/AKT信号通路上调Bcl-2/Bax比值，抑制氧化应激、炎症反应与胃上皮细胞凋亡，完整阐明DYHLS“多成分、多靶点、多通路”的协同护胃机制，同时证实山奈酚是复方关键体内药效标志物，为该古方现代应用及天然胃黏膜保护药物开发提供了物质基础与分子实验依据。