文章标题：Dual targeting of PI3Kδ and PPARα enhances antitumor activity via FoxO1 activation in follicular lymphoma

发表期刊：Cell Death & Disease

影响因子：12.2

客户单位：厦门大学

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

滤泡性淋巴瘤(Follicular Lymphoma, FL)为第二高发的惰性非霍奇金淋巴瘤，一线免疫化疗虽可实现短期疾病缓解，但超半数患者会在10年内复发，且每年存在2%~3%向高侵袭性弥漫大B细胞淋巴瘤转化的风险，复发难治FL仍是临床亟待攻克的治疗难题。PI3Kδ抑制剂林普利塞(Linperlisib)是获批用于多线后复发难治FL的靶向药物，通过阻断驱动B细胞癌变的PI3K/AKT通路发挥抗肿瘤作用；但单药治疗易诱发肿瘤代偿性信号反馈、细胞代谢重塑，进而产生适应性耐药，缓解持续时间有限，大幅限制其临床获益。

FoxO1是PI3K/AKT通路下游核心抑癌转录因子，在FL中持续被AKT磷酸化修饰并滞留于细胞质，丧失调控细胞凋亡、周期进程与代谢稳态的功能；FoxO1活性缺失与肿瘤恶性进展、患者不良预后直接相关，是极具潜力的干预靶点。 西格列他钠(Chiglitazar)为泛PPAR激动剂，对PPARα具备强效激活活性，可重编程肿瘤细胞能量代谢，抑制糖酵解同时促进氧化磷酸化；前期研究证实，PPARα激活一方面通过代谢重塑间接下调AKT活性、缓解AKT对FoxO1的抑制，另一方面能直接转录调控FoxO1，具备恢复FoxO1抑癌功能的双重潜力。

基于两药作用通路互补的特征，本研究提出科学假设：联合林普利塞靶向致癌PI3Kδ信号、西格列他钠靶向肿瘤代谢依赖。其中林普利塞可直接阻断AKT通路，缓解AKT介导的FoxO1失活；西格列他钠则通过代谢调控、PPARα转录激活两条通路共同上调FoxO1。两药协同恢复FoxO1抑癌功能，有望克服PI3Kδ抑制剂单药带来的适应性耐药，为复发难治FL提供全新联合治疗方案。

研究结果

01.林普利塞联合西格列他钠可在体外与体内模型中抑制FL生长

通过体外细胞实验与RL细胞源性异种移植(CDX)动物模型，验证林普利塞联合西格列他钠对FL的抗肿瘤增殖活性。体外层面（图1A–F），研究采用Karpas-422、RL、Sc-1三株滤泡性淋巴瘤细胞开展CCK-8活力检测与台盼蓝活细胞计数，结果显示林普利塞、西格列他钠单药均能明显抑制肿瘤细胞存活，两药联用的抑制效果显著优于单药；联合指数(CI)分析证实两种药物在全部三株细胞中均具备协同抗肿瘤作用。

体内动物实验（图1G–N）选用每组5只CB17-SCID小鼠构建RL-CDX模型，给药处理后，联合用药组肿瘤负荷、肿瘤体积及终点瘤重均显著低于对照组与单药组；肿瘤组织免疫组化结果显示联合组增殖标志物Ki-67阳性率显著降低（图1K–L）；实验期间各组小鼠体重无明显差异，证明该联合方案耐受性良好；HE染色可见联合组肿瘤组织核分裂象减少、坏死区域增多（图1N），进一步佐证联用可显著提升抗肿瘤疗效。

图1.林普利塞联合西格列他钠在体外及体内抑制滤泡性淋巴瘤细胞生长

02.林普利塞与西格列他钠联合用药可激活FL细胞凋亡信号通路

本研究从细胞表型与分子层面证实两药联用可协同诱导滤泡性淋巴瘤细胞凋亡。细胞凋亡流式检测结果（图2A–F）显示，林普利塞、西格列他钠单药均可轻度诱导Karpas-422、RL、Sc-1细胞凋亡，联合处理组凋亡率显著升高，定量分析确认二者存在协同促凋亡效应；GSEA分析显示联合处理细胞凋亡相关基因集显著富集，在转录层面佐证促凋亡表型。

机制层面通过WB检测凋亡通路核心蛋白（图2H–J）：联合用药上调凋亡标志物剪切型PARP，激活线粒体内源性凋亡通路；促凋亡蛋白Bim、Bax表达显著上升，抗凋亡蛋白Mcl-1表达下降，Bcl-2无稳定变化趋势。

综上，两药通过调控Bcl-2家族蛋白、激活caspase信号，协同触发FL细胞凋亡。

图2.林普利塞联合西格列他钠可促进滤泡性淋巴瘤细胞凋亡

03.林普利塞联合西格列他钠诱导FL细胞G1/S期阻滞

本研究从细胞表型及分子层面验证两药联用可阻滞FL细胞周期。EdU增殖实验（图3A–F）结果显示，相较对照组与单药组，联合用药能明显减少Karpas-422、RL、Sc-1细胞的EdU阳性比例，显著抑制细胞DNA合成；细胞周期流式检测（图3G–L）可见联合组G0/G1期细胞占比大幅上升，出现明显G1/S期阻滞；GSEA分析（图3M）显示G1/S转换相关基因集显著负富集，在转录水平印证周期抑制表型。

机制上通过WB检测周期检查点蛋白（图3N–P）发现，联合用药上调周期抑制蛋白p27，下调Cyclin E1、CDK2及其磷酸化形式p-CDK2，破坏介导G1/S转换的CDK2–Cyclin E1功能复合物。

综上，两药协同调控核心周期蛋白，强效阻断FL细胞G1/S期转换。

图3.林普利塞联合西格列他钠诱导FL细胞发生G1/S期细胞周期阻滞

04.转录组分析证实FoxO1是介导林普利塞联合西格列他钠协同抗肿瘤效应的关键效应分子

本研究借助转录组测序挖掘联用方案的核心作用靶点。转录组火山图（图4A）检出大量差异表达基因；KEGG富集分析提示细胞周期、凋亡、FoxO通路为核心变化通路（图4B）；GSEA分析证明FoxO1相关转录程序显著富集（图4C），PI3K通路内CDKN1A、CDKN1B、FoxO家族等基因表达显著波动（图4D）。

分子验证实验（图4E–K）显示：WB结果表明联合用药抑制PI3K/AKT通路活化、特异性上调PPARα与FoxO1，FoxO3/4无明显变化（图4E–G）；亚细胞分离及灰度定量显示FoxO1核蓄积、核质比显著上升（图4H–I）；qPCR证实FoxO1 mRNA上调幅度远高于FoxO3、FoxO4（图4J）；免疫荧光直观印证联合组FoxO1表达与核定位同步提升（图4K）。

综合结果证明FoxO1为PI3K/PPARα下游关键转录分子，介导两药联用诱导的凋亡与周期阻滞。

图4.转录组与分子图谱分析证实FoxO1是联合治疗的核心效应分子

05.代谢组分析表明西格列他钠通过代谢重编程、抑制糖酵解进而激活FoxO1

本研究通过非靶标代谢组学探究西格列他钠调控FoxO1活性的分子机制。RL细胞代谢组结果显示，西格列他钠可显著重塑细胞代谢谱，诱导大量代谢物差异表达（图5A）；差异代谢物的KEGG富集分析提示，FoxO信号通路、碳代谢及肿瘤中心碳代谢为主要调控通路（图5B）。代谢组与转录组联合KEGG分析进一步锁定FoxO信号通路为核心富集节点，证实细胞代谢重塑与转录调控存在紧密关联（图5C）。

功能实验验证，西格列他钠可显著抑制FL细胞糖酵解进程，使细胞葡萄糖摄取、乳酸生成、胞内丙酮酸水平均明显降低（图5D–F）。分子层面检测结果显示，西格列他钠可下调糖酵解关键调控蛋白HIF1α、GLUT1、PGK1的表达，抑制AKT磷酸化；还可阻断FoxO1的T24、S256位点磷酸化，提升FoxO1的核定位能力与转录活性（图5G），同时上调FoxO1的mRNA表达水平（图4J）。

后续机制验证实验明确了PPARα的直接调控作用：双荧光素酶报告实验证实活化的PPARα可显著增强FoxO1启动子活性；生物信息学分析在FoxO1启动子-402/-378 bp区域预测出功能性PPARα应答元件PPRE，突变该基序后，西格列他钠介导的FoxO1启动子激活效应完全消失；ChIP-qPCR实验进一步证实，西格列他钠可促进PPARα与FoxO1启动子结合。

综上，西格列他钠通过双重途径激活FoxO1：一是通过PPARα直接结合FoxO1启动子，实现转录水平激活；二是通过抑制糖酵解通路介导FoxO1翻译后修饰调控，最终与林普利塞协同发挥抗肿瘤作用。

图5.西格列他钠重塑细胞代谢并促进FoxO1活化

06.敲低FoxO1可削弱林普利塞联合西格列他钠对FL细胞的协同细胞毒效应

为验证FoxO1在两药协同抗肿瘤效应中的核心作用，本研究构建两株FoxO1稳定敲低的RL细胞模型(shFoxO1#1、shFoxO1#2)。qPCR结果证实两株细胞FoxO1的mRNA表达分别降至阴性对照组的32%、24%（图6A）；WB及灰度定量分析进一步验证FoxO1蛋白表达分别下调至对照组的50%、37%，敲低模型构建成功（图6B–C）。

细胞功能实验证实FoxO1是介导联合用药药效的关键分子。CCK8实验显示，FoxO1敲低会显著削弱联合用药对RL细胞的增殖抑制作用，细胞活力明显回升（图6D）。Annexin V/PI流式凋亡检测结果表明，敲低FoxO1可显著降低联合用药诱导的细胞凋亡水平（图6E）。EdU增殖实验进一步发现，FoxO1缺失可缓解药物所致的细胞复制应激，恢复肿瘤细胞增殖能力（图6F）。

分子机制层面，WB结果显示，FoxO敲低后细胞内促凋亡蛋白Bim、Bax，以及周期抑制蛋白p21、p27表达显著下调（图6G）。

综上，FoxO1是林普利塞联合西格列他钠诱导FL细胞周期阻滞、细胞凋亡的关键下游效应分子，缺失FoxO1会显著削弱两药联用的抗增殖与促凋亡协同作用。

图6.敲低 FoxO1削弱联合用药诱导的促凋亡与抗增殖效应

07.林普利塞联合西格列他钠在FL PDX模型中协同抑制肿瘤生长并激活FoxO1信号通路

本研究构建滤泡性淋巴瘤患者来源异种移植(PDX)模型，在贴近临床的体系中评估林普利塞联合西格列他钠的治疗效果。肿瘤剥离图像与测量数据证实，相较于对照组与单药组，联合用药组肿瘤体积与肿瘤重量显著降低（图7A–C）。肿瘤生长曲线进一步表明，联合方案对肿瘤进展的抑制作用最强（图7D）。林普利塞单药组小鼠出现轻微体重下降，但联合用药并未加重该现象（图7E）。免疫组化检测及定量结果显示，联合组Ki67染色水平显著下降，提示肿瘤细胞增殖受到明显抑制（图7F-G）。此外，联合组磷酸化AKT表达水平最低，证明 PI3K/AKT 通路抑制效果更强（图7H-I）。与之相反，联合组FoxO1核定位水平最高，说明体内环境下抑制PI3K通路与代谢重编程可协同恢复FoxO1活性（图7J-K）。

综上，以上体内实验证实AKT-FoxO1信号通路是该联合方案治疗滤泡性淋巴瘤的关键下游靶点。

图7.林普利塞联合西格列他钠在滤泡性淋巴瘤PDX模型中协同抑制肿瘤生长并激活FoxO1信号通路

研究小结

本研究系统探究林普利塞联合西格列他钠协同抗滤泡性淋巴瘤的作用机制。体外实验证实两药联用可协同诱导FL细胞凋亡、阻滞细胞周期；借助转录组、代谢组多组学联合分析筛选并锁定FoxO1为核心效应分子。机制研究表明，西格列他钠一方面通过PPARα直接结合FoxO1启动子在转录水平上调FoxO1，另一方面通过抑制糖酵解减少FoxO1抑制性磷酸化，促进FoxO1核蓄积；而林普利塞抑制PI3K/AKT通路活化，两条通路共同形成FoxO1协同调控环路。FoxO1敲低功能缺失实验进一步证实，FoxO1介导联用方案诱导的促凋亡与抗增殖效应。重要的是，FL PDX体内模型验证了联合方案可有效抑制肿瘤生长，且无明显额外毒性，并在体内重现PI3K/AKT抑制及FoxO1通路激活的分子特征。综上，本研究阐明PI3Kδ选择性抑制剂联合PPARα激动剂通过重塑代谢与转录网络激活FoxO1发挥协同抗肿瘤作用，为滤泡性淋巴瘤提供潜在新型联合治疗策略。