发表期刊：British Journal of Pharmacology
发表时间：2022.1
影响因子：8.739
合作客户：上海市第十人民医院、重庆医科大学
百趣生物提供服务：非靶代谢组学
慢性肾脏病（CKD）是一个全球性的公共卫生问题，也是导致死亡的主要原因之一。然而，CKD的发病机制和干预方法尚不完全清楚。因此，一些创新的组学技术被用来研究CKD的发病机制和可能的治疗靶点，包括蛋白质组学和代谢组学，以减缓CKD的进展。
人血浆的代谢组学分析揭示了健康组和尿毒症患者的潜在标志物（PM）
由30名尿毒症患者和30名健康组组成，进行代谢组学分析。为了检验数据的质量，我们首先分析了肌酐质量强度（Cr）与临床试验中肌酐血浆浓度之间的相关性。如图1a、b所示，在阳性模式（图1a）和阴性模式（图1b）中，肌酐强度的对数值与血浆肌酐的对数水平呈良好的线性相关（两种模式中的R值均大于0.9）。
图1. 基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学数据的质量评估
所有组中大多数代谢物的偏差均小于标准偏差的三倍。然而，在所有组中，所有处于正模式和负模式的代谢物的偏差均低于标准偏差的六倍。因此，对样本和质量控制进行无监督主成分分析。然后，对处理后的数据进行监督正交偏最小二乘判别分析。用二维得分图建立一个预测成分和一个正交成分模型，使用方法中描述的标准，确定了18个潜在标记物（表3），其中尿毒症患者血浆中只有一个潜在标记物减少。表中也显示了这些潜在标记。
潜在标志物的相关分析确定TMAO是与CKD进展相关的标志物
对潜在标记物进行定量验证，N-乙酰丙氨酸、D-山梨醇和L-焦谷氨酸被排除在进一步的分析之外。为了确定CKD进展最有希望的标志物，我们对潜在标志物的血浆水平与血浆肌酐和eGFR进行了相关分析。与血浆肌酐呈正相关，与eGFR呈负相关，相关系数大于0.79（表4）。此外，血浆TMAO与血浆肌酐和eGFR的回归分析表明，血浆TMAO与肌酐和eGFR密切相关，相关系数均大于0.8（图3）。
表4. 血浆电位标志物与血浆Cr和eGFR的相关性
图2. 血浆TMAO水平与血浆肌酐TMAO水平相关性图（n=195）
TMAO抑制细胞活性并上调纤维化相关蛋白
为了测试TMAO对肾脏的影响，我们首先测试了TMAO对HK-2细胞的影响。用TMAO处理细胞24小时后，细胞活力略有改变（图4A）。然而，当TMAO浓度小于1.5μM时，将细胞与TMAO孵育48小时可显著降低细胞活力，且呈剂量相关。当TMAO浓度大于1.5μM时，细胞活力似乎达到一个等级（图4B）。此外，用TMAO处理细胞48小时后，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达明显增加（图4C,d），而TGF-β、III型胶原（COL3A1）和纤维连接蛋白的蛋白水平仅略有改变。
图3. TMAO通过促进肾纤维化在体外和小鼠体内引起肾损伤
TMAO在体内引起肾损伤并上调纤维化相关蛋白
给小鼠喂食TMAO后，其体重略有变化，但在视觉上显著降低了肾脏重量（图4f,g）和肾脏与体重的比率（图4h）。相比之下，两组小鼠的心脏质量和心体质量比均无显著变化。给小鼠喂食TMAO可显著提高TMAO（图4i）和肌酐（图4j）的血浆水平。此外，给小鼠提供TMAO可增加α-Sma蛋白的肾脏表达（图4K,l）。
图4. TMAO通过促进肾纤维化在体外和小鼠体内引起肾损伤。
抑制TMAO生成减轻腺嘌呤诱导的体内肾损伤
治疗前，四组小鼠的体重略有不同。与对照饮食相比，ARD饮食的消耗量显著减少。用ARD喂养小鼠可显著降低小鼠体重（图5A）和肾脏重量（图4B）。用抗生素鸡尾酒（ABX）治疗小鼠可减轻ARD诱导的小鼠体重减轻（图5A）。DMB或ABX治疗可减轻ARD引起的肾重量减少（图5b）。ARD喂养显著提高了血浆TMAO水平，而ABX或DMB处理显著降低了血浆TMAO水平（图5c）。正如预期的那样，ARD喂养显著提高了血浆肌酐水平，ABX或DMB治疗显著阻断了这一效应（图5d）。此外，ARD喂养增加了α-Sma的蛋白表达，而ABX或DMB处理会减弱α-Sma的表达（图5e,f）。相比之下，ABX或DMB治疗均未显著逆转ARD诱导的心脏质量下降。
图5. TMAO是减缓小鼠模型肾功能不全的治疗靶点
组织学分析表明，ARD给药导致视觉肾纤维化（图6b,fand S4B），而DMB（图6c）或ABX治疗（图6d）缓解ARD诱导的肾纤维化。图6e和图6j总结了半定量结果。此外，在偏振光显微镜下观察接受ARD的小鼠肾组织的天狼星红染色导致弱折射和浅红色，表明本研究中主要的胶原沉积可能是II型胶原。
图6. 用3,3-二甲基1-丁醇（DMB）或抗生素混合物（ABX）治疗可减轻富含腺嘌呤的饮食（ARD）诱导的肾纤维化
在第一队列中发现的18个潜在标记物中，氧化三甲胺（TMAO）被确定为一个有希望的标记物，并且它与第二队列中CKD患者的肾功能最佳相关。TMAO处理HK-2细胞后，细胞活力降低，α-平滑肌肌动蛋白表达上调。在小鼠中，含有TMAO的饮食减少了肾脏重量，增加了α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达。此外，通过使用3,3-二甲基-1-丁醇抑制TMAO的生物合成途径或使用抗生素混合物破坏肠道微生物群功能来控制TMAO的产生，可以减轻CKD小鼠模型的肾损伤。结论和意义：本次研究数据表明，减少TMAO的产生可能是一种新的策略，可以减轻CKD肾损伤的进展。
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