文章标题：The effects of acetamiprid exposure on osteoporosis: inducing imbalanced bone remodeling by disrupting the equilibrium of adipogenic/osteoblast/osteoclast differentiation

发表期刊：Journal of Hazardous Materials

影响因子：10.6

客户单位：宁夏医科大学

百趣提供服务：蛋白质组学

研究背景

啶虫脒(Acetamiprid, ACE)是一类应用很广泛的新烟碱类杀虫剂，环境介质与人体生物样本中均可检测到啶虫脒及其代谢物。目前针对啶虫脒的毒理学研究多集中于神经毒性、肝、肾毒性等方向，但其对骨代谢的潜在影响尚未得到充分关注。已有流行病学证据提示，ACE及其主要代谢产物N-去甲基啶虫脒(N-dm-ACE)是骨质疏松患病风险的主要相关风险因子，但二者介导骨重塑紊乱的具体效应与关键分子靶点尚不明确。为此，本研究整合网络毒理学、分子对接与分子动力学模拟，结合体内、体外实验，解析ACE与NdmACE诱导骨损伤的效应及分子机制，为新烟碱类农药的人体骨骼健康风险评估提供科学依据。

研究结果

01.ACE和N-dm-ACE的ADMET评估

本研究利用ProTox 3.0、ADMETlab 3.0和VenomPred 2.0开展ADMET及毒理预测，分析ACE及其代谢产物NdmACE的理化及ADMET特征。二者理化参数均符合Lipinski、GSK及金三角规则，具备较好的口服吸收和体内分布潜力。毒性分级提示ACE（3级，吞食有毒）的急性口服毒性高于N-dm-ACE（4级，吞食有害）。药代预测显示，两种化合物肠道通透性高，但可抑制OATP1B1、OATP1B3、MRP1转运蛋白功能；二者均为CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4的底物，其中ACE还可抑制CYP2C8；二者清除率低但半衰期较短，存在组织蓄积倾向。毒性预测结果表明，ACE和N-dm-ACE存在急性毒性、肝肾毒性、神经毒性、遗传毒性、致癌及致突变、生态毒性等多终点风险。结构分析表明，叔氨基对ACE的急性口服毒性起到主要作用，氯代吡啶基团上的氯原子是N-dm-ACE急性口服毒性的关键基团。

02.ACE暴露对小鼠骨组织的影响

本研究构建为期6个月的小鼠ACE口服暴露模型。暴露小鼠第23周体重显著高于对照组（图1a）。LC-MS/MS分析结果证实ACE主要代谢为N-dm-ACE，血清、尿液中Ndm-ACE浓度分别为ACE的11.67倍、40.85倍，代谢产物主要经尿液排泄（图1b-c，表1）。

6个月ACE暴露后，Micro-CT结果显示ACE暴露可损伤骨小梁结构，中、高剂量组BMD、Tb.BV/TV下降，高剂量组Tb.Pf升高、Tb.N降低，皮质骨相关参数无显著变化；SEM观察到中、高剂量暴露组骨小梁稀疏、宽度减小（图1d-h）。血清检测显示ACE暴露后PINP水平下降、CTXI水平上升，提示骨代谢平衡被打破。高剂量组血清Ca²⁺、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，骨组织中炎症因子蛋白表达同步上调（图1i-l）。

图1. 6个月ACE暴露对小鼠骨组织的影响

表1. 小鼠血清与尿液中ACE及NdmACE的浓度

TEM超微结构观察结果显示，与对照组相比，ACE暴露组小鼠骨组织内的骨细胞、成骨细胞和破骨细胞均出现不同程度的线粒体损伤，主要表现为线粒体肿胀、膜结构模糊、嵴结构消失。值得注意的是，尽管破骨细胞同样存在上述线粒体损伤，但其线粒体的数量与密度较对照组明显增加（图2）。

图2. 6个月ACE暴露对小鼠骨组织骨细胞、成骨细胞、破骨细胞线粒体的影响

03.ACE暴露致骨质疏松的核心靶点与通路筛选

为解析ACE及其代谢产物N-dm-ACE诱发骨质疏松(Osteoporosis, OP)的潜在靶点与分子机制，本研究开展网络毒理学分析。利用数据库预测得到ACE潜在靶点157个、N-dm-ACE潜在靶点140个，合并去重后共获得191个化合物靶点（图3a）；共收集2244个OP相关疾病靶点（图3b）。将化合物靶点与疾病靶点取交集，获得66个共同靶点（图3c-d）。将上述交集靶点导入STRING数据库，构建蛋白质蛋白质相互作用(PPI)网络。根据网络拓扑参数筛选得到排名前5的核心靶点，分别为PPARγ、STAT3、EGFR、HIF-1α、NF-κB1；其中PPARγ为ACE与N-dm-ACE共有靶点，STAT3为ACE特异性靶点（图3e）。PPARγ是调控成脂分化的关键转录因子。

GO功能富集分析结果显示，交集靶点主要富集于核受体活性、转录调控、炎症反应等（图3f）。KEGG通路富集共筛选出91条显著富集通路，涵盖破骨细胞分化、钙信号通路、FoxO信号通路、AGERAGE信号通路、AMPK信号通路、细胞凋亡、JAK-STAT信号通路等，提示ACE暴露可通过多条通路共同调控骨质疏松的发生发展（图3g）。

图3. ACE暴露致骨质疏松的网络毒理学分析

04.ACE和N-dm-ACE与核心靶点的分子对接与MD模拟

为进一步探究ACE、N-dm-ACE与骨质疏松排名前5位的核心靶点之间的相互作用，本研究开展分子对接及分子动力学(MD)模拟分析。分子对接结果显示，ACE可与PPARγ、STAT3、EGFR、NF-κB1结合；N-dm-ACE可与PPARγ、HIF-1α、NF-κB1结合。7组复合物均可自发结合，结合能均低于−4.25 kcal/mol（表2）。其中PPARγ与两种化合物的结合亲和力最强，且N-dm-ACE对PPARγ的结合亲和力高于ACE。在PPARγ配体结合结构域中，ACE主要与LYS450、GLN458、LEU459、PHE460残基发生相互作用；N-dm-ACE则作用于VAL321、THR325、VAL343、LYS347、VAL350、GLU499残基，通过范德华力、疏水作用以及氢键等非共价相互作用使复合物保持稳定（图4a）。

分子动力学模拟验证了复合物体系的稳定性。PPARγ-ACE与PPARγ-N--ACE体系分别在40ns、50ns后达到动力学平衡，RMSD值在2~2.5Å 区间波动。Rg、SASA参数出现小幅波动，提示配体结合引起蛋白构象改变；氢键与RMSF分析结果表明，模拟全过程中配体-蛋白之间能够维持稳定相互作用（图4b-f）。

图4. PPARγ与ACE、N-dm-ACE的分子对接及分子动力学模拟

05.ACE暴露对BMSCs成骨-成脂分化的影响

本研究通过体内、体外实验验证ACE对PPARγ/C/EBPα、RUNX2/PPARγ通路及BMSCs分化的调控效应。ACE暴露1、3、6个月小鼠骨组织 HE染色可见中、高剂量组脂滴空泡增多，成脂分化增强（图5a）。WB结果显示暴露组PPARγ、C/EBPα蛋白表达水平升高，RUNX2蛋白表达水平降低，中、高剂量变化最突出（图5b-c）；OCN免疫荧光提示成骨标志物表达下降。

分离6个月暴露小鼠原代BMSCs进行诱导分化，成骨分化时Runx2、Col1a1、Osx表达下调，细胞矿化能力受损；成脂分化时Pparg、Cebpa、Lpl表达上调，成脂分化增强（图5d-g）。综上，ACE通过激活PPARγ/C/EBPα通路促进成脂分化；同时PPARγ竞争性抑制RUNX2，进而抑制成骨分化，造成BMSCs成骨-成脂分化稳态失衡。

图5. ACE暴露对成骨及成脂分化的影响

06.ACE暴露对破骨细胞分化的影响

为探究ACE暴露对破骨细胞分化的作用，本研究开展体内与体外实验。对ACE暴露1、3、6个月小鼠骨组织进行TRAP染色，结果显示高剂量组破骨细胞数量显著增多（图6a-b）。CTSK、MMP9、MMP14为破骨细胞特征标志物；ACE暴露后，中、高剂量组CTSK蛋白表达上调（图6c-d）；免疫荧光结果进一步显示MMP9、MMP14荧光强度升高，以高剂量组最为明显，提示骨吸收活性增强（图6e-f）。

分离ACE暴露6个月小鼠原代BMDMs并诱导破骨细胞分化。ACE暴露组破骨细胞标志基因Rank、Ctsk、Trap的mRNA表达上调；中、高剂量组破骨细胞面积增大，单个破骨细胞核数目增多（图6g-i）。由于破骨细胞分化与炎症反应密切相关，本研究进一步检测Nfkb1、Rela及炎症因子Il6、Tnf、Il1b的mRNA水平。除Il1b无明显变化外，其余基因在ACE暴露组均普遍上调（图6j-k）。上述结果表明ACE暴露可促进破骨细胞分化。

对照组与高剂量组的纯化BMDMs进行蛋白质组学分析，共鉴定得到214个差异表达蛋白，其中上调蛋白161个。KEGG富集分析提示差异蛋白显著富集在溶酶体相关通路，包括CTSS、TPP1、ARSG、CTSO、PPT2、NPC2、AP4E1等蛋白，上述蛋白参与破骨细胞分化及骨吸收过程。

RANKL/RANK/OPG通路是调控破骨细胞功能的关键信号通路。骨组织免疫荧光检测结果表明，ACE暴露组OPG蛋白水平与OPG/RANKL比值下降，RANKL、RANK表达升高，说明ACE诱导的破骨细胞异常分化与RANKL/RANK/OPG通路紊乱密切相关。

图6. ACE暴露对破骨细胞分化的影响

07.PPARγ在ACE和N-dm-ACE诱导的成骨、成脂及破骨细胞分化中的作用

为验证PPARγ介导ACE、NdmACE诱导骨代谢损伤的功能，本研究首先鉴定BMSCs表型，流式结果显示CD73、CD44高表达，CD11b、CD45几乎不表达。CCK-8测得BMSCs的IC₅₀：ACE为4.63 mM，NdmACE为5.35  mM；BMDMs的IC₅₀分别为18.12 mM、24.52 mM，选定1.6 mM作为细胞实验浓度。借助腺病毒构建Pparg敲低细胞模型，免疫荧光与蛋白表达检测证实基因敲低有效。

细胞实验结果表明，同等浓度下N-dm-ACE激活PPARγ的作用强于ACE。ACE和N-dm-ACE会上调PPARγ、C/EBPα蛋白表达，下调RUNX2、OCN蛋白表达（图7a-c）；茜素红染色显示二者抑制矿化结节形成，Pparg敲低可恢复矿化能力（图7d）。成骨分化时，ACE和N-dm-ACE下调Runx2、Col1a1、Osx，沉默Pparg可逆转该抑制效应（图7e）；成脂分化时二者促进脂滴形成、上调成脂基因，敲低Pparg则抑制成脂表型（图7f-g）。综上，ACE及N-dm-ACE通过激活PPARγ，促进BMSCs成脂分化并抑制成骨分化。

图7. PPARγ介导ACE、N-dm-ACE调控BMSCs成骨、成脂分化

为进一步探究PPARγ在ACE、N-dm-ACE诱导破骨细胞分化过程中的作用，本研究检测BMSCs内OPG、RANKL蛋白表达。结果显示，NdmACE处理可显著上调RANKL蛋白表达；ACE、N-dm-ACE处理均会显著降低OPG/RANKL比值，而Pparg敲低能够逆转上述改变（图8a-b）。BMSCs培养上清中OPG/RANKL比值也表现出相同变化趋势（图8c）。

在BMDMs破骨分化体系中，TRAP染色结果表明，ACE与N-dm-ACE处理可显著增大TRAP⁺破骨细胞面积，单个破骨细胞的细胞核数量增多；Pparg敲低后，破骨细胞生成明显受到抑制（图8d-e）。同时，破骨分化相关基因Rank、Trap、Ctsk在ACE、Ndm-ACE处理组表达显著升高，而在sh-Pparg组表达明显回落（图8f）。

BMSC-BMDMs共培养体系也观察到一致结果：ACE、N-dm-ACE处理使TRAP⁺破骨细胞面积、单个破骨细胞核数增大，破骨相关基因表达上调；Pparg敲低可显著拮抗上述促破骨效应（图8g-i）。

以上结果表明，ACE及N-dm-ACE激活PPARγ信号通路，一方面促进BMSCs成脂分化、抑制其成骨分化；另一方面，既通过调控BMSCs中PPARγ介导的RANKL/RANK/OPG通路间接促进破骨细胞分化，也可直接激活BMDMs的PPARγ，促进破骨细胞分化。

图8. PPARγ在ACE、N-dm-ACE诱导破骨细胞分化中的作用

研究总结

本研究综合运用计算毒理学、网络毒理学、分子对接、MD模拟及体内外实验，揭示ACE暴露可诱发骨小梁丢失，改变PINP、CTX-I骨代谢标志物水平，并诱导全身及骨局部炎症反应。经网络毒理学筛选得到PPARγ、STAT3、EGFR、HIF-1α、NF-κB1关键靶点；分子对接与动力学模拟表明ACE、N-dm-ACE可与上述靶点形成稳定结合，其中与PPARγ的结合亲和力最优。ACE及其代谢产物N-dm-ACE可打破成脂-成骨-破骨细胞分化稳态，引发RANKL/RANK/OPG通路失调，促进骨质疏松进展；沉默Pparg可部分逆转上述损伤，提示PPARγ激活在ACE、N-dm-ACE介导的骨重建失衡中发挥关键介导作用。