英文标题：Dynamic regulation of secondary metabolites and agarwood aroma compounds in Aquilaria sinensis by the endophytic fungus NSZJ-CX-22 revealed through metabolomics and GC–MS

发表期刊：Frontiers in Plant Science

影响因子：5.9

合作单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所

百趣提供服务：PRM精准植物广靶

研究背景

沉香是沉香属与拟沉香属植物受胁迫后分泌的名贵芳香树脂，因其独特香气和多重药理活性（如抗炎、镇静、促消化等）被广泛应用于香料、医药和宗教领域，其标志性香气与功效核心源于倍半萜类与2-(2-苯乙基)色酮(PECs)两类特征次生代谢物。然而，天然沉香形成周期漫长、野生资源稀缺，持续扩张的市场需求加剧了野生种群过度采伐，使其被列入CITES保护名录。目前，人工诱导成为破解资源供需矛盾的核心方向，已发展出物理创伤、化学试剂和生物接种等三类技术。其中，内生真菌生物诱导因可模拟自然防御响应、激活特征代谢通路，成为最具产业化潜力的技术方向。现有研究证实，内生真菌可激活茉莉酸、水杨酸等激素信号网络，上调萜类合酶、聚酮合酶、查尔酮合酶等关键酶表达，驱动黄酮、苯丙烷、萜类三大代谢通路通过共享前体协同合成沉香特征成分。但真菌诱导始终存在“品质不稳定、难以标准化量产”的瓶颈。基于此，本研究以内生真菌NSZJ-CX-22为对象，构建无菌白木香木屑发酵体系，结合广靶代谢组与GC-MS技术开展时序动态分析，旨在揭示核心代谢通路的交汇调控机制，明确前体代谢与特征成分合成的定量关系，为标准化真菌结香生产提供理论与实验依据。

研究结果

01.不同培养阶段菌株NSZJ-CX-22的代谢组整体特征

方法上，研究采用内生真菌NSZJ-CX-22(Arthrinium sp.E14020a)构建非活体木屑固态发酵体系，分别于接种后第7、14、21、28天取样，并基于广泛靶向代谢组学进行检测分析（图1）。

图1.真菌培养及下游代谢分析实验流程示意图

通过UPLC-MS/MS平台和自建代谢物数据库，总计14784种代谢物被鉴定，覆盖11大物质类别（图2A），其中萜类（3360种，含421种倍半萜）、黄酮类（1564种）、生物碱类（1487种）为核心类群。

多元统计分析显示，各时间点样本与空白培养基在主成分分析中分离清晰（图2B），表明真菌作用下基质代谢组发生了显著时序性变化。其中，7d与14d代谢特征相近，21d与28d出现明显分化，整体呈现“前期代谢稳定、后期代谢流重分配”的规律。倍半萜与色酮的层次聚类热图进一步证实，组间代谢异质性随培养时长逐步增强，“14-21d”为代谢网络发生剧烈重构的关键阶段（图2C）。在代谢调控层面，次生代谢物的时序合成受CHS、TPS、PKS、P450等关键酶驱动；碳水化合物、氨基酸、核苷等初级代谢物的动态变化与次生代谢时序高度耦合，作为前体库为次生代谢持续提供碳氮骨架与能量支撑。

图2.白木香木屑培养基中内生真菌代谢组的时序分析

02.不同培养时间点差异代谢物的差异分析

通过空白培养基与四个时间点（7、14、21、28天）的对比，研究鉴定出14,555种差异代谢物，明确了该菌株在木屑基质中的核心代谢轮廓：初级代谢以脂肪酸为核心组分（占比83.4%），支撑着生物量构建与次生代谢能量供给；次生代谢以萜类、黄酮、生物碱为主体，占比达78.9%，具备强劲的次生代谢合成能力。另外，沉香特征香气相关核心代谢物（118种沉香特征倍半萜骨架与PECs成分）被特异性检出；黄酮、苯丙烷、萜类三大通路通过共享前体（乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A等）和分支关键酶（CHS、TPS、P450等）实现代谢交汇，且受茉莉酸信号协同调控。相关性热图分析，初级基质利用与次生代谢物合成间存在显著的阶段特异性资源权衡（图3）：发酵前期(7-14d)初级营养消耗与次生代谢积累呈强负相关，碳氮源活跃转化以启动次生代谢（图3A-B）；发酵中后期(14-21d)代谢重心在次生代谢分支间转移，苯丙烷下游分支发生代谢流重定向（图3C-D）。组间动态显示：“7d vs 14d”的嘌呤代谢和脂氧合酶途径上调，与黄酮糖苷拮抗（图3E）；“14d vs 21d”的糖酵解中间产物与萜类合成呈高度正相关，同时芪类和原花青素被抑制，标志着碳流集中向关键倍半萜骨架合成（图3F）。

图3.内生真菌NSZJ-CX-22培养过程中初级代谢与次生代谢的相关性热图

K-means聚类将整体代谢动态划分为三个特征阶段（图4）：①营养消耗与前体积累期(0-7d)，初级代谢物快速降解，早期倍半萜初步合成；②次生代谢合成爆发期(7-21d)，沉香特征倍半萜与色酮大量积累，防御性代谢物同步上调；③代谢重构与修饰期(21-28d)，特征成分经P450发生氧化修饰，苯丙烷代谢枢纽重新激活。

图4.所有差异代谢物的K-means聚类分析

03.不同培养时间内生真菌NSZJ-CX-22的代谢动态与沉香特征成分积累规律

为明确菌株代谢产物的时序积累特征，研究以空白培养基为对照，在设置的4个关键采样点（接种后第7、14、21、28天）中筛选相关差异代谢物。结果显示，各时间点与对照相比，存在11,733个差异代谢物，其中6041种在全培养周期内均发生显著变化，证实菌株全程维持稳定的核心代谢网络（图5A）。另外，差异代谢物整体呈现“14天合成峰值—21天代谢低谷—28天小幅回升”的时序规律：第14天差异物数量达最高；第21天因合成前体大量消耗，上调代谢物数量骤降；第28天代谢活性略有恢复但未回到前期水平（图5B-E）。

图5.内生真菌NSZJ-CX-22动态代谢特征与不同培养时间点沉香特征代谢物积累模式的相关性分析图

初级代谢层面，氨基酸、核苷与糖类含量在第21天降至最低，脂肪酸则在7-28天持续维持高位，反映菌株通过将短效碳氮源转化为长效能量储备，适应基质消耗的生长胁迫（表1）。

表1.各培养时间点初级代谢物上下调数量变化统计

次生代谢层面，含沉香特征骨架的倍半萜早期合成最为活跃，黄酮类总量整体稳定，色酮类在第21天出现含量低谷（表2）。

表2.各培养时间点次生代谢物上下调数量变化统计

基于VIP值筛选的关键差异物，研究进一步明确各阶段的代谢调控特点（图5F-I）：培养早期萜类与聚酮通路激活，中期次生代谢与防御响应同步增强，后期代谢发生重构、防御类生物碱上调。据此，研究提出分段采收策略：倍半萜组分宜在7-14天采收，色酮生产应避开第21天能量低谷，可利用21-28天的P450修饰作用提升香气结构多样性。

04.相邻培养时间点内生真菌NSZJ-CX-22的代谢动态与关键差异代谢物

为解析菌株代谢特征的连续演变规律，研究对相邻时间点(BM vs 7d，7d vs 14d，14d vs 21d，21d vs 28d)进行了配对比较分析。共鉴定出13,043种差异代谢物，其中395种在所有阶段均持续变化，表明培养时长是调控菌株代谢活性的关键因素（图6A）。另外，菌株整体代谢呈现显著的三阶段特征（图6）：①快速激活期（0-7天），物质合成与降解活性均较高且基本平衡；②稳定期（7-21天），上调和下调的代谢物数量均持续减少，整体代谢活性显著降低（图6B-C）；③胁迫复苏期（21-28d），代谢水平显著恢复，上调的合成代谢物和下调的降解代谢物数量同步快速增加（图6D）。基于VIP值筛选的关键差异代谢物，各相邻阶段的核心调控特征（图6E-G）也被进一步明确：“7d vs 14d”，生物碱、有机酸类下调，内酯、糖苷类上调，反映代谢通路转换；“14d vs 21d”，酚酸类下调，内酯、磷酸戊糖通路中间产物上调，表明氧化应激缓解、特异性通路激活；“21d vs 28d”，赤霉素、部分萜类下调，三萜皂苷、倍半萜醇等防御与香气相关物质上调。综上，菌株代谢呈现“快速激活-稳定调控-应激复苏”的三阶段时序模式，初级代谢的物质周转与次生代谢的防御适配共同支撑了菌株在木屑基质中的持续生长与功能代谢。

图6.相邻培养时间点内生真菌NSZJ-CX-22代谢动态变化与关键差异代谢物相关性分析图

05.不同培养时间差异代谢物的KEGG通路富集分析

通过KEGG通路富集分析，研究进一步揭示内生真菌NSZJ-CX-22的代谢调控网络是以黄酮类生物合成（包括黄酮、黄酮醇及异黄酮）为核心，并伴随辅因子生物合成的协同激活（图7A）。这些核心通路的显著富集贯穿整个培养过程，但调控重心随时间动态演变：早期（0-7天），代谢以激活萜类和聚酮类次生代谢、建立基础能量储备为主（图7B）；中期（7-21天），代谢特征转向次生代谢增强、氧化应激响应及能量利用优化，防御功能进一步加强（图7C-D）；晚期（21-28天），代谢调控聚焦于核心防御性次生代谢物（如三萜皂苷和生物碱）的合成及能量代谢优化（图7E）。相邻时间点的动态分析显示，富集通路总数随培养进程呈下降趋势，表明代谢调控逐渐收敛于核心路径。具体而言，“7-14d”是从基础防御向高效次生代谢的转变期（图7F）；“14-21d”调控核心从氧化应激转向特定次生代谢物合成（图7G）；“21-28d”则高度聚焦于核心防御性次生代谢物的合成（图7H）。

图7.代谢通路分析KEGG富集气泡图

在白木香木屑基质中，萜类与黄酮类代谢通路呈现出“全局协同，局部竞争”的调控模式。二者共享上游碳源（如乙酰辅酶A），存在资源分配的权衡，但均被基质诱导而全局上调，共同构成应对胁迫的防御网络（图8）。

图8.白木香纯培养模型中的核心次生代谢通路

06.不同培养时间点挥发性代谢物的组成与动态变化

为解析内生真菌NSZJ-CX-22在白木香基质中诱导沉香香气形成的化学基础，研究采用GC-MS技术对不同培养阶段的挥发性代谢物进行系统分析，共鉴定116种挥发性代谢物，涵盖17个化学类别，其中芳香化合物、萜类与色酮类是构成沉香特征香气的核心组分（图9A）。多元统计分析表明，菌株挥发性代谢谱具有显著时间依赖性。PCA显示，各时间点样本代谢特征分离清晰，21d与28d样本聚类紧密，与7d样本差异显著，表明培养后期发生了明显的代谢重编程（图9C）。基于OPLS-DA模型，26种关键差异代谢物被筛选。结合热图聚类可将挥发物积累划分为三个阶段（图9D-E）：①营养转化与抗氧化期(0-7d)，菌株消耗基质底物供能，同时色酮衍生物快速积累以应对氧化应激；②特征香气合成关键期(14-21d)，倍半萜前体与芳香化合物显著上调，奠定沉香独特香韵的化学基础；③防御增强与修饰期(28d)，酚酸与含氮化合物升高，CYP450介导的氧化修饰与防御代谢同步增强。综上，菌株通过“早期抗氧化、中期合成香气、晚期强化防御”的时序代谢策略，塑造了沉香浓郁独特的香气特征，同时也维持其环境适应性。

图9.菌株NSZJ-CX-22在不同培养时间点挥发性代谢物的鉴定及多变量统计分析

研究总结

本研究通过代谢组学与GC-MS技术，系统揭示了内生真菌NSZJ-CX-22在白木香木屑基质中诱导沉香形成的动态代谢调控机制。结果显示，该菌株的代谢过程呈现“前体库消耗-途径汇聚-时序编程”的三阶段特征：

①营养转化期（0-7天），菌株快速消耗初级代谢物并积累色酮类物质以应对氧化应激；

②香气合成期（7-21天），倍半萜与芳香化合物爆发式积累，于第14天达到峰值，奠定了沉香特征香气的化学基础；

③防御增强期（21-28天），代谢活动转向CYP450介导的氧化修饰，合成酚酸等防御性物质。

此外，研究证实，黄酮类、苯丙素类和萜类三大核心途径通过共享前体（如乙酰辅酶A）和关键酶(CHS，TPS，PKS)实现协同调控，并受茉莉酸信号驱动。该成果不仅阐明了真菌诱导沉香香气形成的化学本质，更为实现沉香生物制造的标准化、分段式采收提供了精确的理论依据与工艺指导。