文章标题：Small extracellular vesicles derived from adipose mesenchymal stem cells alleviate intestinal fibrosis by inhibiting the FAK/Akt signaling pathway via MFGE8

发表期刊：Journal of Gastroenterology

影响因子：6.9

客户单位：中山大学附属第六医院

百趣提供服务：Label free定量蛋白质组学

肠纤维化是克罗恩病(Crohn’s disease, CD)最常见和最严重的并发症之一，越来越多的研究表明，脂肪间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡(adipose mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles, AMSC-sEVs)可以缓解肾纤维化、肝纤维化等，但其治疗肠纤维化的潜力尚不确定。因此，本研究旨在确定AMSC-sEVs对肠纤维化的治疗作用，并确定这些作用的机制。

为探究sEVs是否作为AMSC抑制肠道纤维化的旁分泌介质，收集了两种不同的培养基，即条件培养基(Conditioned medium, CM)和不含sEV的条件培养基(Conditioned medium without sEVs, RCM) （图1A），然后将它们分别与肌成纤维细胞共培养48小时。CM能降低TGF-β1刺激的成纤维细胞中胶原蛋白I表达，抑制肠道纤维化，而RCM可逆转此效果，表明AMSCs通过分泌sEVs发挥抗纤维化作用（图1B-C）。此外，蛋白质印迹结果显示，用AMSC-CM处理的小鼠的胶原蛋白I表达低于模型组，但RCM逆转了这一变化（图1G）。这些结果表明AMSC-sEVs可能在体外和体内减轻肠道纤维化。使用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和蛋白质印迹法对AMSC-sEVs进行表征，发现AMSC-sEVs呈典型形态，粒径43-100nm，符合sEV鉴定标准。

2.AMSC-sEVs抑制成纤维细胞活化

共聚焦图像显示AMSC-sEVs位于肌成纤维细胞的细胞质中，表明AMSC-sEVs可以被肌成纤维吞噬（图2A）。为了研究AMSC-sEVs对抑制肌成纤维细胞活化的影响，用TGF-β1刺激的人肠成纤维细胞(Human Intestinal Fibroblast, HIFs) 和CCD18co进行处理；与模型组相比，无论sEVs的浓度如何，AMSC-sEVs都能抑制胶原蛋白I的表达，浓度达到 20μg/ml时效果最明显（图2B-E）。因此，选择20μg/ml的AMSC-sEVs用于后续的体外实验。此外，AMSC-sEVs阻止了TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，随着这种转化的抑制，COL1A1和MMP2的表达降低（图2D-G）。

3.AMSC-sEVs可逆转两种肠道纤维化模型中的纤维化

为追踪输注的AMSC-sEVs在体内的生物分布，将CM-DiR标记的AMSC-sEVs腹腔注射到2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)诱导的小鼠体内。在注射sEVs后24和48小时对小鼠进行体内荧光成像，并在小鼠处死后新鲜解剖并收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和结肠用于后续测试，发现AMSC-sEVs主要分布在结肠（图3A）。

为了测试AMSC-sEVs的效力，我们将其（每只小鼠每天30μg，连续7天）应用于右旋糖酐钠盐(Dextran sodium salt, DSS)诱导的肠道纤维化小鼠模型中。在DSS模型中，AMSC-sEVs显著减轻了结肠缩短和重量/长度比，降低了纤维化评分（图3B-E）。通过蛋白质印迹法评估的胶原蛋白I水平以及通过RT-qPCR测量的纤维化指数（COL1A1和MMP2）在模型小鼠的结肠中在AMSC-sEV治疗后也显著降低（图3F-G）。

4.AMSC-sEVs的蛋白质组学分析

为鉴定AMSC-sEVs中的稳定蛋白质，使用SwissProt数据库在sEVs中鉴定出357种蛋白质，其中10种蛋白质的表达倍数变化在1.2或以下。我们关注抗纤维化相关蛋白质，并选择MFGE8、FBLN1和 Rac1进行进一步研究。此外，发现FAK和PI3K-Akt信号通路与AMSC-sEVs中蛋白质相关的信号通路最为密切相关。

5.MFGE8在体外和体内减少肠纤维化

如图4A所示，MFGE8以剂量依赖的方式有效降低了TGF-β1存在下HIFs中胶原蛋白I的水平。然后使用500 ng/ml MFGE8进行后续的体外实验，证明了MFGE8可以有效降低HIFs和CCD18co中纤维化生物标志物的表达。

此外，为了探索MFGE8在体内的作用，将MFGE8腹腔注射到实验性小鼠结肠纤维化模型中，发现MFGE8给药显著减轻了肠道纤维化，表现为结肠延长和结肠重量/长度比降低（图4C-D）。与模型组相比，MFGE8显著降低了小鼠结肠的内镜和纤维化评分（图4E-F）；在另一种TNBS诱导的小鼠肠道纤维化模型中，观察到MFGE8的类似作用，进一步证实了MFGE8在减轻肠道纤维化中的作用。

6.MFGE8沉默的sEVs不能减轻肠道纤维化

为了进一步确定MFGE8是否参与AMSC-sEVs对肠道纤维化的影响，在AMSCs中敲除MFGE8。发现与AMSC-sEV siControl处理的细胞相比，胶原蛋白I蛋白产生增加（图5A-C），COL1A1和MMP2 mRNA表达增加（图5B-D）。此外，将AMSC-sEVssiMFGE8腹腔注射到DSS诱导的肠道纤维化小鼠模型中，发现与AMSC-sEV siControl相比，AMSC- sEVssiMFGE8的应用导致内镜评分和纤维化评分增加（图5F-G）。在TNBS诱导的肠道纤维化模型中重复了实验，得到了类似的结果，进一步证实了AMSC-sEVs通过MFGE8发挥抗肠道纤维化作用。

7.AMSC-sEVs转移的MFGE8通过抑制FAK/Akt信号通路减轻HIF的纤维化

KEGG通路分析揭示了sEV相关的FAK通路的改变，该通路参与了皮肤、肺和肾脏中的各种纤维化过程（图6A）。此外，对于HIFs，TGF-β1激活了FAK/Akt通路，增加了p-FAK和p-Akt的磷酸化。同样，在DSS诱导和TNBS诱导的肠道纤维化模型小鼠中证实了MFGE8沉默导致的FAK/Akt通路重新激活。因此，我们推测AMSC-sEV siControl通过抑制FAK/Akt信号通路来治疗肠道纤维化。

本研究验证了AMSC-sEVs在体内外可减轻肠纤维化，且可能通过MFGE8抑制FAK/Akt信号通路实现，为临床治疗长纤维化提供理论依据。