文章标题：Proteomic analysis of the faba bean-wheat intercropping system in controlling the occurrence of faba bean fusarium wilt due to stress caused by Fusarium oxysporum f. sp.fabae and benzoic acid

发表期刊：BMC Plant Biology

影响因子：5.3

客户单位：云南农业大学

百趣生物提供服务：Label free定量蛋白质组学

蚕豆(Vicia faba L.)是中国西南地区最重要的豆科作物之一。但长期单作，会导致蚕豆枯萎病发病率升高，产量和品质下降。已有研究表明，蚕豆与小麦间作可有效缓解蚕豆的自毒作用，抑制蚕豆枯萎病的发生。本研究假设苯甲酸是促进蚕豆枯萎的一种重要自毒物质，旨在通过Label free定量蛋白质组学检测与分析，研究蚕豆枯萎病发生过程中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. Fabae, FOF)和苯甲酸(benzoic acid)的作用，揭示蚕豆与小麦间作减轻枯萎病发生的潜在机制。

1、FOF和苯甲酸胁迫间作对蚕豆幼苗生长的影响

作者采用蚕豆单作（M组）和蚕豆小麦间作（I组）两种种植模式，分别在FOF单一胁迫（M+F组、I+F组）、FOF和苯甲酸复合胁迫（M+F+B组、I+F+B组）下进行水培实验。结果显示，与M组相比，M+F组蚕豆的各项生长指标（株高、单株叶数、主根长度和根干重）均受到抑制。在进一步添加苯甲酸(M+F+B组)后，这种抑制效果更为显著。与单作组（M组、M+F组、M+F+B组）相比，间作处理（I组、I+F组、I+F+B组）的株高、单株叶数、主根长度和根干重均显著增加，增幅范围为11.51%-35%（图1）。

图1  苯甲酸胁迫下间作对蚕豆幼苗生长的影响

2、单作和间作模式下FOF和苯甲酸胁迫下蚕豆根的蛋白质组学分析

在外源添加苯甲酸和接种FOF的条件下研究了单作（M组）和间作（I组）蚕豆根系蛋白质表达谱的差异。与M组相比，M+F处理组中共鉴定出22个差异表达蛋白，且均表达上调。相较于M+F处理组，M+F+B组共鉴定到16种差异表达蛋白，其中11种表达上调，5种表达下调。与M+F+B处理组相比，I+F+B组共鉴定出13个差异表达蛋白，其中4个表达上调，9个表达下调。此外，与M+F组相比，I+F组中共鉴定出22个差异表达蛋白，包括15种上调和7种下调表达蛋白（图2）。

图2  单作和间作模式下FOF和苯甲酸胁迫下蚕豆根部差异表达火山图

3、通过COG功能注释分析对蚕豆根部差异表达蛋白进行分类

通过COG功能注释分析对蚕豆根部差异表达蛋白进行分类。与M组相比，M+F组中鉴定出的差异蛋白在碳水化合物转运与代谢、核糖体结构与生物合成、能量代谢、氨基酸转运与代谢、核苷酸转运等方面富集。与M+F组相比，M+F+B组中的差异蛋白在分子功能方面富集于碳水化合物转运和代谢、能量代谢、蛋白质转化、翻译和功能预测等。相较于M+F+B组，I+F+B组中富集的差异蛋白涉及碳水化合物转运和代谢、核糖体结构和生物发生、能量代谢、脂质转运和翻译、代谢等。与M+F组相比，I+F组中富集的差异蛋白在碳水化合物转运和代谢、核糖体结构和生物发生、能量代谢、氨基酸转运和代谢、核苷酸转运和代谢、染色质结构和动力学等分子功能方面发挥作用（图3）。

图3  单、间作FOF和肉桂酸胁迫下蚕豆根系差异表达蛋白COG分析

4、蚕豆根差异表达蛋白的GO功能富集分析

对差异蛋白进行细胞成分分析显示，差异蛋白质中，主要有细胞质成分、细胞核成分，上调蛋白富集于蛋白酶体核心复合物、胞外区、核糖体、线粒体和膜成分，下调蛋白富集于核小体、核糖体、膜成分和细胞质。对差异蛋白进行分子功能分析表明，富集的上调蛋白涉及丙酮酸羧化酶活性、内肽酶活性、GTPase活性、钙结合、β呋喃糖苷酶活性、核糖体结构组成、激酶活性和细胞色素c氧化酶活性等途径，而富集的下调蛋白涉及DNA结合、氧化还原酶活性、金属离子结合、核酸结合、血红素结合和铁离子结合等途径。

5、蚕豆根差异表达蛋白的KEGG富集分析

基于差异表达蛋白进行KEGG富集分析。结果显示，M+F处理组中富集的差异蛋白主要涉及氧化磷酸化、代谢途径、核糖体合成和RNA转运4条途径。与M+F组相比，M+F+B组差异蛋白主要富集于代谢通路、碳代谢、氨基酸生物合成、丙酮酸代谢。与M+F+B组相比，I+F+B组差异表达蛋白富集于代谢富集途径、次生代谢物的生物合成、氨基酸的生物合成和RNA降解。与M+F组相比，I+F组差异表达在蛋白酶体和苯丙烷生物合成通路富集（图4）。

图4  FOF和苯甲酸胁迫下蚕豆根部差异蛋白途径的富集

6、蚕豆根中差异表达蛋白的相互作用

基于差异表达蛋白进行相互网络分析。M+F+B与M+F组相比，有3个蛋白相互作用节点，(a) G7L7H0 和 G7KVS0、(b) G7JEN5 和 A0A072UAH3、 (c) G7JEN5 和 G7KVS0。涉及的蛋白质有苹果酸酶、转酮醇酶、酮戊二酸脱氢酶和3,4-二羟基-2-丁酮激酶，其功能主要在于分子功能和维持细胞内氧化还原稳态。（图5）

图5  蚕豆根部差异表达蛋白之间的相互作用

本研究分析了蚕豆与尖孢镰刀菌相互作用过程中蛋白质表达的变化，结果表明，接种FOF后，蚕豆的生长受到显著抑制，蚕豆通过上调参与氧化还原和细胞壁功能等蛋白质，启动对FOF胁迫的防御反应。进一步添加苯甲酸后，细胞膜的稳定性和蚕豆根系防御系统被破坏，蚕豆通过上调与防御、氧化还原和能量相关的蛋白质来应对FOF和苯甲酸的双重应激。而蚕豆与小麦间作促进了乙烯和茉莉酸的合成，提高了蚕豆植株的抗逆性，有效缓解了FOF和苯甲酸的胁迫。通过上调次生代谢物的生物合成、光合作用的碳固定和其他相关蛋白质来抑制蚕豆枯萎病的发生。通过探讨蚕豆与小麦间作控制蚕豆枯萎病发生的机制，为间作防治病害提供科学合理的理论支撑。