英文标题：DIA-based serum proteomics revealed the protective effect of modified siwu decoction against hypobaric hypoxia

中文标题：基于DIA的血清蛋白质组学揭示改良四物汤对低压缺氧的保护作用

发表期刊：Journal of Ethnopharmacology

影响因子：5.4

文章简介

急性低压缺氧易致多器官功能障碍，缺氧诱导的疲劳会限制运动能力，还会加剧氧化应激损伤脑、骨骼肌等氧敏感器官。临床常用药乙酰唑胺(ACZ)虽能缓解缺氧损伤，但存在肢体麻木、嗜睡等毒副作用，安全防治需求尚未满足。中医理论中，低压缺氧损伤与“血虚血瘀”契合，四物汤(SWD)是经典补血方剂，改良四物汤(MSWD)加入桃仁与红花强化补血活血功效，且已被证实有抗炎、抗氧化等多种生物活性，理论上对低压缺氧损伤有保护作用。

但目前MSWD针对低压缺氧所致损伤的保护效果缺乏系统报道，作用机制不明。基于DIA模式的质谱技术可精准捕捉血清低丰度蛋白变化，为解析其机制提供支持。故本研究通过动物实验结合DIA血清蛋白质组学，探究MSWD对低压缺氧的保护作用及机制，并验证其安全性，为其成为防治急性缺氧疲劳候选药物提供依据。

技术路线

研究内容

1、改良四物汤(MSWD)对低强度运动的影响

在探究MSWD对低强度运动的作用时，研究以C57BL/6J雄性小鼠为实验对象，通过低压缺氧舱模拟7000m海拔环境构建缺氧模型，随后开展无负重游泳试验(NWBST)评估相关指标变化。实验结果显示，经2天低压缺氧暴露后，模型组(Mod)小鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(UREAL)、肌酸激酶(CK)及乳酸(Lac)水平较空白对照组(Ctrl)显著升高（图1B），提示缺氧联合低强度运动已造成小鼠机体损伤。而经阳性药物乙酰唑胺(ACZ，100mg/kg)及MSWD中、高剂量(10g/kg、20g/kg)处理后，血清中上述部分损伤指标呈明显下降趋势，表明ACZ与 MSWD(10g/kg、20g/kg)可有效缓解缺氧叠加低强度运动引发的机体损伤。

进一步检测肌肉与肝脏组织指标发现，MSWD能轻微降低模型组小鼠肌肉中升高的UREAL与Lac含量（图1C）；在肝脏组织中，MSWD的改善效果更为显著，可使模型组中升高的LDH、UREAL及CK水平明显降低（图1D）。

值得注意的是，在常氧环境下，对小鼠连续灌胃MSWD9天后开展NWBST（每只小鼠游泳10min），结果显示MSWD组血清中丙二醛(MDA)及白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平与Ctrl组无显著差异，提示MSWD在常氧条件下对低强度运动无明显改善作用。

图1. 低压缺氧暴露2天及无负重游泳试验后，研究设计的示意图概况与生化指标检测结果

2、MSWD显著提高缺氧后小鼠的高强度运动耐力

小鼠经2天低压缺氧（模拟7000m海拔）暴露后，开展力竭游泳试验（沉水10s不浮起为终点），并检测相关指标。结果显示，小鼠体重变化及RBC、HGB 等造血指标，与缺氧后无负重游泳试验(NWBST)趋势一致（图2A）。与Ctrl组相比，Mod组平均力竭游泳时间缩短53.40%（平均38min）（图2B）；ACZ及MSWD干预后存活时间显著延长，其中MSWD中剂量组(10g/kg)平均存活时间达144min，较Mod组提升279.18%（图2B）。

生化指标方面，Mod组血清UREAL、Lac（图2C）及肌肉、肝脏LDH、UREAL、Lac（图2D-E）均较Ctrl组显著升高；MSWD可降低上述异常指标，证实其能通过改善缺氧引发的代谢紊乱与组织损伤，提高小鼠急性低压缺氧后的高强度运动耐力。

图2. MSWD显著提升缺氧暴露后小鼠的抗疲劳能力

3、MSWD显著提高小鼠对低压缺氧的适应能力

小鼠经2天低压缺氧暴露后，研究通过多指标检测探究MSWD对其缺氧适应能力的影响。

结果显示，Mod组血清血管内皮生长因子（VEGF，缺氧损伤标志物）及红细胞中2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG，无氧代谢指标）均急剧升高，MSWD 或ACZ干预后二者明显恢复（图3A-B）。氧化应激方面，Mod组血清、肌肉中丙二醛(MDA)显著升高，MSWD可有效降低其水平，且对血清MDA的缓解效果更稳定（图3C）。

血液流变学检测中，Mod组外周血低、高切率有上升趋势（无统计学差异），MSWD干预后虽红细胞计数(RBC)仍较高，但外周血低切率显著降低，改善血液流动性（图3D-E）。炎症反应上，Mod组血清IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子升高，MSWD可下调促炎因子并上调抗炎因子IL-10（图3F）。

综上，MSWD通过调节缺氧损伤标志物、抑制氧化应激、改善血液流变学及平衡炎症反应，显著提高小鼠对低压缺氧的适应能力。

图3. MSWD改善代表急性低气压缺氧损伤的血液学指标

4、对照组、模型组和改良四物汤组小鼠血清蛋白质组的表征

研究采用DIA血清蛋白质组学技术，对Ctrl、Mod、MSWD-M三组小鼠血清蛋白进行表征分析。结果显示，共鉴定到927个蛋白组，蛋白强度动态范围跨7个数量级，非单肽鉴定蛋白组平均肽段数约8个，鉴定质量可靠（图4A-B）；三组约87.8%蛋白组重叠，Mod组特有40个蛋白组（图4C）。

主成分分析(PCA)表明三组样本区分良好，Ctrl组异质性最低，MSWD-M组在第一主成分上更接近Ctrl组（图4D）；相关性分析显示，Ctrl组内样本相关系＞0.90，MSWD-M组与Ctrl组相关系数约0.88，显著高于Mod组与Ctrl组的0.80，提示MSWD干预后血清蛋白组特征更贴近正常状态。

以“FC＞2且P＜0.05”筛选差异表达蛋白(DEPs)：Ctrl与Mod组间有338个DEPs（252个上调、86个下调，图4E），上调DEPs富集于糖酵解、HIF-1信号通路等，下调DEPs富集于血小板活化、凝血级联反应等；MSWD-M与Mod组间有201个DEPs（30个上调、171个下调，图4F），为解析MSWD调控缺氧的机制提供靶点。

图4. DIA蛋白质组学数据的质量控制以及Ctrl、Mod和MSWD组之间差异表达蛋白的筛选

5、改良四物汤改善缺氧后失调的氧化应激和脂质代谢

将MSWD组与Mod组的201个DEPs，与Mod组和Ctrl组的338个DEPs对比，共得到165个共有 DEPs，这些蛋白在MSWD组均显著逆转Mod组的异常表达趋势（图5A-B）；GO富集显示其参与氧化应激反应等过程，功能聚类分为氧化应激相关（如 Prdx2、Sod1）和泛素-蛋白酶体系统相关（如 Usp14）两大集群（图5C, 5E）。

此外，MSWD组与Mod组的36个特有DEPs中，32个符合改善趋势的蛋白参与胆固醇等生物合成（图5D）；最终鉴定的15个关键蛋白（图5F）中，氧化应激相关蛋白（Gstp1、Sod1等）在MSWD组降低，脂质代谢相关蛋白（Ube20、Apoa1等）在MSWD组升高，证实MSWD可通过下调氧化应激、调控脂质代谢，改善缺氧损伤。

图5. MSWD对低气压缺氧的调控关键通路和蛋白质

6、ELISA验证血清中关键差异表达蛋白

选取8个蛋白通过ELISA验证血清蛋白质组学准确性，结果显示：Mod组中Apoa1、Apoa5、Vat1含量较Ctrl组显著降低（图6A-C），Usp14、Prdx2、Sod1则显著升高（图6D-F），Gstp1、Rad23a无显著变化。经MSWD干预9天后，Mod组中含量显著变化的上述血清蛋白(Apoa1、Apoa5、Vat1、Usp14、Prdx2、Sod1)在MSWD组中明显恢复（图6A-F）。

图6. 血清蛋白质组学中差异蛋白的验证

7、改良四物汤无明显急性毒性

急性毒性实验显示，MSWD组器官系数、器官损伤相关生化指标与Ctrl组相比无显著变化（图7A-B）；HE病理染色显示，MSWD组心、肝、脾、肺、肾的整体结构和组织均无明显异常（图8），这些结果表明MSWD安全性良好，单次大剂量口服对主要器官无明显毒性。

图7. 急性毒性研究中对照组和MSWD组小鼠的器官指数和血清损伤生物标志物的变化

图8. MSWD急性毒性试验中小鼠重要器官的HE染色

研究结论

本研究以低压缺氧损伤为核心，结合动物实验与DIA血清蛋白质组学技术，系统探究改良四物汤(MSWD)的保护作用及安全性。结果显示，MSWD可通过增加小鼠外周血红细胞数量、改善血液流变学指标，降低血清及肝肌中损伤标志物，提升运动耐力与缺氧环境存活时间，缓解缺氧损伤与疲劳；DIA分析证实其能下调氧化应激及泛素-蛋白酶体系统相关蛋白，上调脂质代谢相关蛋白，逆转165个缺氧相关差异表达蛋白(DEPs)的异常表达，改善代谢紊乱；单次大剂量口服无明显毒性。综上，MSWD对低压缺氧保护效果明确且安全性佳，为急性缺氧疲劳防治提供了潜在候选药物。

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