英文标题：A telomere-to-telomere gap-free assembly integrating multi-omics uncovers the genetic mechanism of fruit quality and important agronomic trait associations in pomegranate

发表期刊：Plant Biotechnology Journal

影响因子：10.5

作者单位：中国农业科学院郑州果树研究所

百趣提供服务：花青素高通量靶标定量

首个石榴端粒到端粒(T2T)参考基因组图，为石榴的品种改良和培育提供了重要的理论基础和技术支持。

研究背景

石榴作为"超级水果"兼具营养与经济价值，但其育种受限于三大瓶颈：

基因组缺陷：已有4个版本基因组，最好的仍然存在188个间隙，端粒/着丝粒结构未知，仅鉴定了有限数量与农艺性状相关的基因。

性状机制不明：花色苷合成（果皮颜色）和种子硬度调控网络未解析。

缺乏基因编辑平台：无CRISPR验证体系阻碍分子育种。

研究结果

1、石榴完整基因组及其非典型端粒结构

本研究组装了一个无缺口的高质量参考基因组命名为Moshiliu，包含8条染色体，总长度为366 710 298 bp（图1a，表1）。还分别检测到总共16个端粒区域和8个着丝粒区域（图1a）。石榴中的所有16个端粒区域都呈现非典型TTTTAGGG基序（图1a），并且与具有保守TTTAGGG基序的其他植物相比，存在T插入。使用(TTTTAGGG)4探针的荧光原位杂交(FISH)分析也证实了端粒的分布。16个端粒的平均长度为5.1 kb（图1c），平均端粒重复拷贝数为582（图1d）。为了研究其他千屈菜科物种是否也呈现出不寻常的端粒基序，检查了海桑、紫薇和水杨梅的端粒基序，这些都呈现出独特的TTTTTTAGGG基序（图1e）。相比之下，其他桃金娘目物种呈现典型的端粒序列TTTAGGG（图1e），表明这些不寻常的端粒基序可能对千屈菜科物种的进化产生了重大影响。

图1 石榴无缺口基因组组装的全基因组图谱及非典型端粒基序分析

2、石榴的rDNA和卫星重复序列

在石榴中，5S rRNA主要通过5S rDNA的转录产生（图2a），18S、5.8S和28S rRNA主要由一个45S转录物的剪接产生（图2b）。与FISH结果一致，分别鉴定了位于近端着丝粒染色体1（图2c）和2（图2d）上的45S rDNA的主要2.65 Mb阵列和5S rDNA的625.6 kb阵列。45S rDNA和5S rDNA的簇分别包含约835和2006个基因单位（图2a-d）。45S rDNA阵列包含195.8 kb TE; 5S rDNA阵列包含14.4 kb TE（图2d）。约33%的随体重复位于着丝粒区域，染色体长度和着丝粒定位之间无明显相关性（图2e）。两个卫星重复序列（CL 2和CL 6）主要位于着丝粒区，占这些序列的70.7%（图2e）。根据CL 2和CL 6随体重复序列的比例，着丝粒可分为3种结构类型。对于染色体1、2、5、6和8，CL 2（比例为51.1%-99.3%）和CL 6（比例为21.9%-99.8%）重复序列几乎覆盖了所有着丝粒区域（图2e）。相比之下，染色体7被CL 7完全覆盖（100%），染色体4由CL 16组成（图2e）。

3、石榴与其他植物的比较基因组学分析

根据系统发育分析估算，千屈菜科物种（石榴、八宝树和大花紫薇）的共同祖先，与野牡丹科（野牡丹）及桃金娘科（巨桉和番石榴）物种的共同祖先分化时间约在8378万年前（图2f）。巨桉的全基因组复制事件发生在该物种与石榴的分化时间之前（图2h）。大花紫薇的全基因组三倍化事件（Ks值为0.42）则略晚于该物种与石榴的分化时间（石榴Ks值为0.45）（图2g-h）。长末端重复逆转录转座子的插入时间分布（这类转座子在植物进化中具有重要作用）也佐证了所得的石榴分化时间线（图2i）。

图2 石榴基因组结构及其与其它植物的比较基因组学分析

4、146份石榴种质资源的变异图谱

本研究对142份石榴地方品种和改良品种进行了全基因组重测序，数据用于全基因组关联分析。另从NCBI公共数据库获取了4个品种的基因组数据。经去除接头序列和低质量序列过滤后，共获得1.79 Tb高质量数据，样本平均覆盖深度达33×。

采用缺失率≤10%且次要等位基因频率≥0.01的高质量SNP，构建了146份石榴种质材料的系统发育关系，结果显示其分为6大遗传类群：第I组包括主要来自以色列、意大利、美国和土库曼斯坦的种质;第II组包括来自中国的种质;第III组包括来自印度、沙特阿拉伯和中国的种质;第IV、V和VI组主要包括来自中国和美国的种质（图3a）。群体结构分析和主成分分析在很大程度上证实了这些结果（图3b-c）。

图3 146种石榴的系统发育关系和种群结构

5、一种独特的染色体易位破坏PgANS表达导致石榴花色素苷缺陷

石榴果实的色泽对果实的品质和商品价值有重要影响，因此本研究对三个石榴品种--“‘Sanbai”（白色）、“M0109”（红色）和“Moshiliu”（黑色）的果皮的花青素苷浓度和组成进行了测量（图4a），结果表明，白色果皮中花青素苷积累不足，而黑色石榴果皮中花青素苷水平高。矢车菊素和飞燕草素是决定石榴果皮颜色的主要成分。根据GWAS，确定了1号染色体上与白色果皮连锁的一个主要位点（见图4 b）。选择主要SNP chr 1：84.73 Mb用于LD衰减分析，确认Chr 1：84.72-84.85 Mb含与白色果皮颜色相关的13个候选基因（图4c）。

以白、红、黑三种果皮颜色不同的品种为材料，通过转录组分析研究了花后30、50、120天果皮的变化。在13个鉴定的候选基因中，Pgr01G046260（命名为PgANS），其被注释为花青素苷合酶，相对于白色果皮，在有色果皮中强烈上调（图4d-e）。qRT-PCR分析进一步证实了PgANS在有色果皮中比在白色果皮中发生更高表达（图4f）。

有趣的是，研究发现PgANS的CDS区域中的37.2-Kb染色体易位与石榴中的白色果皮颜色强烈相关（图4e）。对11个白色品种和11个有色品种进行基于PCR的筛选，进一步验证了这种染色体易位与果皮颜色之间的关联（图4g）。鉴定的染色体易位破坏了PgANS的CDS结构域，导致在白色果皮中几乎没有PgANS表达（图4d-f）。

为深入解析PgANS在石榴花青素合成缺陷中的作用机制，本研究构建了靶向PgANS基因的CRISPR-Cas9基因编辑载体，并转化至红皮石榴品种'Nana'中。基于PCR的全长PgANS测序鉴定出两个突变株系，Pgans-1：在PgANS编码区第153 bp处发生1-bp C缺失，Pgans-2：在PgANS编码区第152 bp后插入1-bp T（图4h）。这两种类型的突变导致PgANS翻译的过早终止（图4h）。PgANS的敲除系显示花青素苷缺乏（图4i）。

“Tunisia”和“Moshiliu”的比较结构变异分析揭示了PgANR的启动子区域中的重复扩增（图4j）。基于PCR的筛选发现了石榴品种中PgANR基因的不同启动子变异。与红色和白色型相比，起始密码子上游的989-bp序列被对应于黑皮型中特异性1056-bp重复扩增所取代（图4k）。结构变异可能会降低启动子活性，导致黑果皮中PgANR表达水平降低（图4l），从而限制花青素向原花青素的转化，并导致黑果皮表型。

图4 破坏PgANS的独特染色体易位导致石榴中出现白色果皮

6、PgNST3保守区非同义SNP变异影响种子硬度

石榴籽硬度是影响其食用品质的最重要因素，主要由内种皮的厚度决定（图5a）。与硬籽品种相比，软籽品种的内种皮显著更薄（图5b）。内种皮包括三个细胞层：薄壁组织层(PCL)、厚壁组织层(SCL)和厚壁组织层(PL)（图5c）。次生细胞壁的厚度是决定种子硬度的主要因素，花后30-50天是种子硬度形成的关键时期。硬种子硬化层在花后50至120天的持续显著增厚，而在软种子品种中没有检测到该层的显著增厚（图5c）。

通过GWAS在1号染色体上发现了一个与种子硬度相关的主基因座（图5d）。主导SNP位于Pgr01G048970基因的166 bp编码区（图5e）。Pgr01G048970被预测编码一个长度为416个氨基酸的NAC结构域蛋白，其在拟南芥(AtNST3)和玉米(ZmNST3)中的同源蛋白已被证实是调控次生细胞壁厚度的主开关。因此将Pgr01G048970命名为PgNST3，该基因中的非同义SNP(G→A)导致保守DNA结合区（NAM结构域）发生E56→K氨基酸替换，从而形成两种基因型：PgNST3^G（硬籽型）和PgNST3^A（软籽型）。为验证观察到的PgNST3 SNP变异是否与石榴种子硬度相关，通过一代测序对80份具有不同种子硬度的石榴种质进行SNP分型，结果显示该变异对表型的预测准确率达100%（图5f）。

此外，通过连锁不平衡衰减区段和RNA测序数据进一步确认调控石榴种子硬度的候选基因。在chr01:87.18-87.26 Mb区间锁定一个控制种子硬度的候选位点（74.8 kb），该位点包含九个候选基因。通过观测花后20、30、50、90及120天(DAF)内种皮硬度变化（图5g），发现九个基因中PgNST3的表达模式与种子硬度表型高度关联（图5h），该结果在3个硬籽型和3个软籽型材料的qRT-PCR实验中得以验证（图5i）。上述证据共同支持PgNST3是调控石榴种子硬度的核心候选基因。

为明确PgNST3^G与PgNST3^A等位基因对种子硬度的作用，本研究将35S::PgNST3^G和35S::PgNST3^A构建体转化至番茄（Micro-Tom品种）。表型观测显示，35S::PgNST3^A转基因株系T2代种子相较于野生型（图6e）呈现显著缩小的种皮（图6a-c）及软化表型（图6d），而PgNST3^G过表达株系未现明显变化。

通过表达谱分析与NAC结合元件(SNBE)预测，锁定五个候选下游转录因子。其中双荧光素酶报告系统证实，35S:PgNST3^G与ProPgMYB46:LUC共浸润时荧光活性显著增强，而35S:PgNST3^A共浸润组与阴性对照相比无活性（图6f-g）。电泳迁移率变动分析进一步证实PgNST3^A丧失结合PgMYB46启动子的能力（图6h）。上述证据表明PgNST3^G能直接激活PgMYB46转录，而PgNST3^A无此功能。最终证实PgNST3基因的G→A非同义突变削弱了PgNST3^A与PgMYB46启动子的结合能力，从而导致软籽石榴内种皮增厚受限（图6i）。

图5 种子硬度相关基因PgNST3

图6 PgNST3A的过表达导致番茄种子柔软

研究结论

资源突破：

全球首个石榴T2T基因组（端粒/着丝粒全解析）

发布146种质变异图谱+CRISPR编辑体系

育种应用：

开发PgANS/PgNST3分子标记→实现苗期性状预测

软籽基因编辑为木本果树育种提供新工具

理论创新：

发现植物界首个TTTTAGGG端粒结构

揭示次级细胞壁增厚新调控网络

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