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技术介绍 | iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组学

发布时间 2022-10-24

iTRAQ（Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation）和TMT（Tandem Mass Tags）技术是分别由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术，采用多种同位素的标签，可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）反应实现连接，通过高精度质谱分析，同时实现多个样本蛋白组的定性和定量。

iTRAQ/TMT试剂由三部分组成∶报告基团、平衡基团和反应基团。反应基团形成2-18种等质量同位素标签。iTRAQ/TMT试剂标记酶解后的肽段的N端及赖氨酸侧链氨基。在MS/MS分析中，每个同量异序标签都能够产生一个独特的离子图谱，因此可以利用该标签进行定量。在一级质谱分析中，标记的多肽是无法彼此区分出来的。然而，在二级质谱模式下，报告基团、平衡基团和反应基团之间的键断裂，带不同同位素标签的同一肽段产生质量不同的报告离子。通过比较二级谱图中的不同报告离子的强度就可以对蛋白进行定量。

图1.png

iTRAQ-4plex等重标签结构

应用方向

▶ 生物疾病发生发展过程分子机制研究

▶ 生物疾病标志物研究

▶ 新型病毒抑制因子挖掘研究

▶ 药物作用靶点研究

▶ 药物作用机理研究

技术优势

▶ 适用范围广

可检测到的蛋白除了胞浆蛋白外，还有线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白。也能对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量、酸性、碱性蛋白质。

▶ 高通量

一次可以实现多个样品的定性定量分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。

▶ 结果可靠

基于高灵敏度和高分辨的串联质谱方法，定性与定量同步进行，同时得出定性和定量结果，重复样品间的蛋白表达量相关性高。

▶ 灵敏度高

分级分离，降低样品复杂度，相比凝胶电泳观测到的蛋白变化在2倍以上，iTRAQ计算出的蛋白变化在通常1.3-1.6倍之间，可检测低丰度蛋白。

▶ 分离能力强

可分离出酸/碱性蛋白，小于10KDa或大于200KDa的蛋白、难溶性蛋白等。

▶ 自动化程度高

液质联用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

技术流程

图2.png

技术参数

▶ 样本要求

动物及临床组织标本：100 mg/sample

血清、血浆：200 μL/sample

细胞、微生物：1×10⁷cells/sample

液氮或-80℃保存

足量干冰运输，避免反复冻融

▶ 产品类型

标记定量蛋白组

▶ 仪器平台

Orbitrap系列Q Exactive HFX，Thermo/Orbitrap Exploris 240，Thermo等）

▶ 搜库软件

Proteome Discoverer/MaxQuant

案例分析

图3.png

文章标题：Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags(TMT)Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue

研究对象：小鼠附睾脂肪组织

期刊：Molecular&Cellular Proteomics

影响因子：6.54

技术方法：TMT标记定量蛋白质组

研究内容

肥胖症是一种世界性流行病，与代谢并发症如2型糖尿病、高血压、血脂异常和动脉粥样硬化的发病率增加有关。过去由于缺乏有效的高通量技术手段限制了对附睾组织的整个脂肪组织蛋白质组变化的研究。因而作者利用多组高通量TMT标记定量蛋白组技术对小鼠附睾组织的蛋白质组进行了深入的研究。

研究路线

技术介绍 | iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组学(图4)