文章标题：Plasma proteomics identifies proteins and pathways associated with incident epilepsy
发表期刊：Cell Reports Medicine
影响因子：14.0
研究背景
癫痫是一类复杂难治的神经系统疾病，目前临床诊断主要依靠病史采集、发作期临床记录与头颅影像学评估，尚无便捷、可常规应用的外周血液生物标志物用于早期筛查；血浆蛋白质组学凭借高通量、可纵向监测的优势，为癫痫早期病理识别与发病机制研究提供新方向。但既往癫痫蛋白组研究多局限于动物模型、术后或尸检人脑组织，存在样本获取难度大、样本量偏小、多为横断面设计、检测蛋白覆盖度有限等缺陷，难以系统刻画临床癫痫发病前数年血浆蛋白动态变化规律，也缺乏大型前瞻性队列同步系统阐释血浆蛋白变化与脑影像学、应激生活事件、癫痫遗传易感性三者之间的关联规律。
本研究依托英国生物样本库(UK Biobank)包含52372名基线无癫痫人群的大型前瞻性队列，纵向探究2920种血浆蛋白表达与远期新发癫痫发病风险的关联。研究证实外周特征蛋白可在癫痫临床确诊十余年前出现异常，明确免疫应答通路是致痫进程的核心调控通路；同时发现血浆蛋白表达与应激生活事件的关联程度显著超过遗传易感性。该成果为癫痫外周早期血液标志物挖掘、致痫分子机制阐释及靶向药物研发提供了大样本人群队列证据。
研究结果
01.大规模人群血浆蛋白组筛选锁定与新发癫痫风险显著关联的特征蛋白
为系统解析2920种血浆蛋白与成人新发癫痫的关联规律，挖掘早期预警标志物，本研究基于UK Biobank 52372名基线无癫痫受试者队列，构建校正多混杂因素的Cox比例风险回归模型，开展全人群、年龄、性别、糖尿病/肾功能、发病随访时长、癫痫亚型分层分析，并结合横断面数据验证结果。
结果显示：经Bonferroni多重检验校正后，共筛选出103个与新发癫痫风险显著相关的血浆蛋白，其中神经丝轻链多肽(NEFL)、生长分化因子15(GDF15)的关联强度最高（图1A）。按年龄分层可见，60岁以下人群存在33个显著关联蛋白，60岁及以上人群仅21个（图1B-C）；性别分层结果显示，男性亚组仅17个蛋白显著关联癫痫，女性亚组仅37个（图1D-E）；合并糖尿病、轻度肾功能下降人群中，符合显著关联标准的蛋白数量明显减少。
短期发病（≤5年）、长期发病（＞5年）分层分析中，NEFL、GDF15均呈现稳定关联；两种癫痫亚型各存在4种特异性蛋白：局灶性癫痫特异性蛋白为LRG1、HAVCR2、VSIG4、SPINK1，全面性癫痫特异性蛋白为BCAT1、GDF15、SOD2、GAGE2A，其中GDF15同时为全人群通用高危标志物。横断面线性回归验证共得到192个差异蛋白，其中29个与纵向分析的关联趋势、显著性完全吻合（图1F）。
综上，血浆蛋白与新发癫痫的关联存在年龄、性别、合并症、发病时长、疾病亚型异质性；NEFL、GDF15在绝大多数分层亚组中均稳定显著相关，是覆盖全人群、不同发病时长的核心癫痫高危血浆标志物。
图1. 2920种血浆蛋白与新发癫痫的关联性研究
02.癫痫前驱期血浆蛋白的时序动态演变与轨迹聚类特征
基于已筛选出的103个新发癫痫相关血浆蛋白，本研究进一步解析其发病前长期表达变化规律，血浆时序蛋白特征可反映致痫病理进程，是实现癫痫超早期预警的关键。研究构建1:10匹配病例对照队列，采用LOESS回归拟合确诊前14.6年蛋白变化轨迹，以Z分数评估蛋白异常程度，并借助无监督层次聚类划分蛋白动态表达模式。
时序分析结果显示，除肾素(REN)外，剩余102个相关蛋白均在癫痫确诊前发生表达紊乱（图2A）；研究设定|Z|＞0.25为蛋白异常标准，其中30种蛋白早在发病前15年即出现异常。TNFRSF10B、GFAP等5种蛋白全程持续高表达，UMOD、RAB6A、CNTN5则长期低表达，提示各类蛋白在致痫过程中作用存在差异。核心标志物NEFL、GDF15分别于确诊前14.2年、11.2年开始上调并持续升高，拥有极长的早期预警时间窗口。
轨迹聚类将102个蛋白分为3类非线性变化簇，各簇阶段特征清晰（图2B–D）：Cluster1包含NEFL、GDF15，蛋白水平持续上升并于发病前5年达峰，对应慢性神经损伤与炎症长期累积；Cluster2呈渐进升高趋势，在确诊时达到峰值，代表发作前夕急性病理激活；Cluster3全程维持低表达，且随病程进展持续下降，三类轨迹分别匹配癫痫不同病理阶段。
结合功能富集解析轨迹生物学意义：高表达蛋白主要富集于神经损伤、免疫炎症通路，低表达蛋白多参与血脑屏障稳态与代谢调控，整体时序变化契合 “慢性炎症累积 — 神经损伤加重 — 临床癫痫发作” 完整病理链。综合时序定量、聚类分型、功能注释三重证据证实，癫痫属于慢性进展性脑病而非突发放电疾病，不同动态特征的血浆蛋白可用于癫痫早期筛查、病程分层监测。
图2. 癫痫确诊前血浆蛋白的时间动态演变及其轨迹聚类分析
03.免疫应答通路是癫痫关联血浆蛋白的核心功能富集特征
完成103个新发癫痫关联血浆蛋白的筛选后，其生物学功能与调控网络尚未明确，鉴于免疫炎症紊乱在癫痫发生发展中的关键作用，本研究进一步从通路注释、表型验证、转录调控、蛋白互作四个层面开展系统功能解析。GO与KEGG通路富集分析显示，癫痫关联蛋白显著富集于胞外区、胞外空间、胞外外泌体等细胞组分，核心功能集中在细胞因子 - 细胞因子受体相互作用、信号转导、蛋白结合等模块，代谢类通路未呈现统一的富集规律（图3A）。
基于MGI数据库的表型富集分析进一步证实，癫痫关联蛋白在免疫系统表型上富集程度最高，其次为造血系统表型与肿瘤表型，该结果从表型层面印证免疫功能异常是癫痫发病的核心表型基础（图3B）。
为解析蛋白异常表达的上游调控机制，研究利用TRRUST数据库开展转录因子靶标富集分析，共鉴定出 15 个关键调控转录因子，其中JUN、SP1、RELA、GATA2、NFKB1富集显著性最高。上述均为炎症与应激反应通路的核心调控分子，据此可推测炎症转录程序激活是驱动癫痫关联蛋白表达异常的重要上游机制（图3C）。
为明确蛋白间的协同调控关系并筛选核心枢纽分子，研究基于STRING数据库构建蛋白-蛋白互作网络，103个癫痫关联蛋白间共形成236对互作关系，呈现高度的功能互联性；借助cytoHubba插件排序后，筛选出TNFRSF1A、CD274、HAVCR2、TIMP1四个核心枢纽蛋白，其中TNFRSF1A作为调控炎症反应与细胞存活的关键受体，在整个调控网络中居于核心地位，该发现与既往癫痫免疫机制的研究结论高度一致（图3D）。
图3. 癫痫相关蛋白的生物学功能分析
04.癫痫关联血浆蛋白与致痫脑区结构损伤存在广泛关联
为探究癫痫关联血浆蛋白与中枢致痫病理的对应关系，明确外周蛋白对脑结构改变的提示价值，本研究整合血浆蛋白质组与多维度脑影像数据，采用经FDR校正的线性回归模型，系统分析103个癫痫关联蛋白与全脑灰质、皮层表型及白质微结构的关联。
结果显示，36个蛋白与全脑皮层灰质体积显著相关，46个蛋白关联皮层下灰质体积，另有4个蛋白与脑白质高信号负荷存在相关性，可见外周蛋白与各类脑结构指标存在广泛统计学关联（图4A）。 皮层表面积分区分析显示，左侧顶下小叶、双侧内侧眶额叶、脑岛等致痫相关脑区的皮层表面积与多种癫痫关联蛋白显著相关（图4B）；皮层体积层面，左侧颞中回、双侧脑岛等脑区多与癫痫关联蛋白呈负相关，仅UMOD与左侧颞中回体积呈正相关，基于该关联可推测蛋白表达升高多伴随灰质萎缩改变（图4C）。 皮层下核团分析可见，双侧海马、丘脑、苍白球等核心致痫脑区均与10种以上蛋白显著相关；海马、丘脑灰质体积大多与蛋白水平负相关，侧脑室容积则与蛋白呈正相关，该关联模式符合灰质萎缩继发脑室扩张的病理特征（图4D）。
白质弥散张量(DTI)分析显示，左侧上纵束、双侧前丘脑辐射等关键神经纤维束微结构指标与多种血浆蛋白显著相关，提示外周蛋白异常常伴随脑白质微结构改变（图4E）。其中NEFL、GDF15、GFAP在内共16种蛋白可同时关联10个以上脑结构指标，是衔接外周分子改变与中枢脑损伤的关键分子。
图4. 癫痫相关蛋白与脑结构的关联分析
05.环境应激而非遗传易感性调控癫痫关联血浆蛋白并介导发病风险
受103个癫痫关联血浆蛋白筛选结果的启发，研究系统解析癫痫多基因风险评分(PRS)与各类应激事件对上述蛋白的调控作用。PRS可量化个体癫痫遗传易感水平，应激暴露是已知癫痫诱发因素，但二者通过血浆蛋白介导致痫进程的分子机制尚不清晰。多基因风险评分关联分析显示，仅15个蛋白存在名义显著性关联，经多重检验校正后均未达到统计学阈值（图5A），提示遗传易感性对癫痫相关血浆蛋白的整体调控效应微弱。
对应激事件分层分析显示，经FDR校正后共有56个蛋白与至少一类应激显著相关；其中39个关联成年应激、35个关联童年应激、44个关联终身应激，LAYN、PIGR、GFRA1为终身应激相关性排名前三的蛋白，另有19个蛋白同时与三类应激均显著相关。核心风险蛋白GDF15的表达水平可随童年应激、终身应激暴露显著上升（图5B）。
为探究蛋白的中介作用，本研究构建结构方程模型(SEM)，模型结果显示童年、成年、终身应激均可通过改变血浆蛋白水平产生显著间接效应，证明血浆蛋白可作为应激暴露诱发癫痫的关键中介分子（图5C–E）。
综合遗传关联、应激关联、中介效应三重分析结果可见，相较于遗传易感性，环境应激是调控癫痫关联血浆蛋白的核心因素，血浆蛋白在应激介导的致痫通路中发挥重要中介作用。
图5. 癫痫相关蛋白与遗传及应激相关事件的关联
06.多蛋白标志物组合可有效预测未来新发癫痫的远期发病风险
为系统评估血浆蛋白对未来新发癫痫的预测效能，构建基于外周蛋白的癫痫风险预警模型，本研究采用LightGBM机器学习算法，基于基线血浆蛋白质组数据构建发病预测模型，分层验证不同时间窗口与癫痫亚型的预测表现。
特征重要性排序与渐进式筛选结果显示，按预测贡献度选取前100个蛋白逐步纳入模型，纳入约30个核心蛋白后AUC提升趋于平缓，由此确定最优多蛋白特征集合（图6A）。
ROC曲线验证结果显示，针对全随访期新发癫痫，模型平均AUC为0.681，具备中等强度预测效能（图6B）；针对基线后10年内发病的短期预测，模型AUC可达0.701（图6C）；针对10年以上的远期发病风险，模型预测效能最优，AUC可达0.754，提示血浆蛋白对癫痫远期发病的预警价值更为突出（图6D）。
亚型分层分析进一步显示，全面性癫痫预测AUC为0.68，局灶性癫痫预测AUC为0.62，两类亚型核心预测蛋白重叠度极低，说明不同癫痫亚型存在各自特异的血浆蛋白标志物谱特征。
图6. 癫痫发作的预测及用于预测未来癫痫发作的ROC曲线
研究总结
本研究揭示了外周血浆蛋白组预警新发癫痫及免疫炎症介导致痫进程的新机制。依托超5万人大型纵向队列筛选出以NEFL、GDF15为核心的103个癫痫关联血浆蛋白，其表达异常早于临床确诊十余年，通过免疫应答通路介导癫痫发生发展；相较于遗传易感性，环境应激对该血浆蛋白谱的调控作用更为突出。分子机制上，癫痫关联蛋白与海马、丘脑等核心致痫脑区的灰质萎缩、白质损伤高度相关，TNFRSF1A、CD274等免疫枢纽蛋白构成蛋白互作网络核心，参与全身免疫炎症相关病理改变。基于上述血浆蛋白标志物构建的预测模型可有效评估个体未来癫痫发病风险，对10年以上远期发病的预警效能更佳，NEFL、GDF15可作为癫痫超早期筛查的潜在外周生物标志物。该研究完整刻画了癫痫前驱期外周病理的长期演变规律，也为癫痫的早期预警、病因分型及免疫靶向治疗提供了重要的理论支撑与实践依据。
