文章标题：Integrated analysis of network pharmacology and multi-omics reveals the mechanisms of Zuogui Jiangtang Qinggan formula ameliorates MASLD via fatty acid metabolic reprogramming

发表期刊：Phytomedicine

影响因子：11.3

客户单位：湖南中医药大学

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro、中药成分鉴定、蛋白质组学、转录组学

研究背景

代谢功能障碍相关脂肪性肝病(Metabolic dysfunctionassociated steatotic liver disease, MASLD)全球患病率已达30.2%，常伴随2型糖尿病、胰岛素抵抗、血脂紊乱，疾病持续进展可诱发肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，是严峻的公共卫生问题。现有临床一线干预药物包括GLP1激动剂、他汀类、贝特类等，存在肝肾毒性、停药反弹等缺陷，急需安全有效的替代方案。

中医药具备多靶点、低毒的优势，左归降糖清肝方(Zuogui Jiangtang Qinggan formula, ZGJTQGF)由经典方剂左归丸化裁而来，为院内制剂，针对气阴两虚证MASLD，可改善高糖、高脂状态以及肝脏损伤，但该复方完整的分子作用机制尚未阐明。单一组学仅能反映分子层面的单一变化，难以诠释中药复方多通路协同调控的特点。本研究整合网络药理学、代谢组、转录组、蛋白组多组学技术，结合分子对接、动物与细胞实验，挖掘复方入血活性成分，围绕脂肪酸代谢重编程，解析其调控糖脂、胆汁酸代谢的核心通路，系统阐明该方改善糖尿病相关MASLD的分子机制，为该中药复方干预代谢相关脂肪性肝病提供实验理论依据。

图形摘要

研究结果

01.ZGJTQGF改善db/db小鼠胰岛素抵抗与糖耐量

通过高脂饮食诱导db/db小鼠建立MASLD动物模型，设立正常对照组、模型组、二甲双胍组、左归降糖清肝方高、低剂量组进行药物干预。检测体重、肝指数、摄食量、饮水量、口服葡萄糖耐量试验(Glucose Tolerance Test, OGTT)、空腹血糖、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数(Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance, HOMAIR)相关指标。结果显示，模型组小鼠体重、肝指数、摄食量、饮水量、OGTT曲线下面积(AUC)、空腹血糖、空腹胰岛素、HOMAIR均显著增高，表现出严重的胰岛素抵抗；ZGJTQGF干预后可降低上述指标，有效改善糖耐异常与胰岛素抵抗（图1AI）。

图1. ZGJTQGF对db/db小鼠体重、肝脏指数、饮食、OGTT、胰岛素抵抗和葡萄糖稳态的影响

02.ZGJTQGF对db/db小鼠血脂紊乱、肝功能及肝脏脂质蓄积的作用

对各组小鼠血脂、肝损伤指标及肝脏组织病理学进行检测后发现，模型组总胆固醇(Total Cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglycerides, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase, AST)显著升高，高密度脂蛋白胆固醇(Highdensity lipoprotein cholesterol, HDLC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)明显降低；HE染色可见模型组肝细胞内大量脂滴堆积，伴肝细胞气球样变性。ZGJTQGF可下调TC、TG、LDLC、ALT、AST水平，上调HDLC、GSHPx水平，显著减少肝细胞内脂质沉积，改善脂代谢紊乱与肝损伤（图2AD）。

图2. ZGJTQGF对db/db小鼠脂代谢及肝脏脂质蓄积的影响

03.ZGJTQGF治疗MASLD的成分-靶点网络分析

采用UPLCQTOF/MS分析ZGJTQGF含药血清，鉴定入血成分（图3AB），结合网络药理学与分子对接开展研究；共得到52种入血化合物，涵盖黄酮、酚类、生物碱等多种类型；依据口服生物利用度、类药性筛选得到14种活性药效物质。将复方潜在靶点与MASLD疾病靶点取交集，得到195个共有靶点（图3C），经PPI网络拓扑分析筛选获得74个核心靶点（图3D）。GO功能富集提示靶点涉及脂质代谢、炎症反应等生物学过程；KEGG富集分析显示AMPK、PPAR、FXR为核心调控通路（图3F）。进一步构建活性成分靶点相互作用网络（图3E），并开展分子对接结果表明，汉黄芩素、柚皮素、槲皮素、丹参酮 ⅡA、小檗碱与通路关键靶蛋白的结合能均＜−5.0 kcal/mol，提示各活性成分与核心靶点具备较高结合亲和力（图4）。

图3. ZGJTQGF治疗MASLD的靶点预测

图4. 活性成分与核心靶点的分子对接

04.ZGJTQGF干预db/db小鼠肝脏代谢物的变化

采用非靶标代谢组检测各组小鼠肝脏代谢物，PCA分析可见模型组与 ZGJTQGF给药组代谢谱存在明显分离（图5A）；共筛选得到439个差异代谢物，其中138个上调、201个下调（图5B）。差异代谢物热图可直观反映组间代谢物表达的整体差异（图5C），火柴杆图展示各差异代谢物的变化幅度（图5D）；通路富集结果提示，差异代谢物主要富集于牛磺酸和亚牛磺酸代谢、初级胆汁酸生物合成、不饱和脂肪酸生物合成等通路（图5E），提示ZGJTQGF可调控肝脏脂肪酸与胆汁酸相关代谢通路。

图5. ZGJTQGF 干预后db/db小鼠肝脏代谢物变化

05.ZGJTQGF干预db/db小鼠肝脏转录组分析

对各组小鼠肝脏组织开展蛋白组检测，PCA分析结果显示模型组与ZGJTQGF给药组蛋白表达模式存在明显区分（图7A）；共鉴定得到2312种蛋白，筛选获得305个差异蛋白，其中162个上调、133个下调（图7B）。KEGG通路富集结果提示差异蛋白主要富集于AMPK信号通路、PPAR信号通路、胰岛素信号通路（图7C）。多组学联合分析，结果表明脂肪酸代谢、能量代谢、AMPKPPAR信号通路以及胆汁酸代谢是ZGJTQGF发挥药效的核心调控网络（图7D）。

图6. ZGJTQGF对db/db小鼠肝脏转录组表达的影响

06.ZGJTQGF干预db/db小鼠肝脏蛋白组分析

对各组小鼠肝脏组织开展蛋白组检测，PCA分析结果显示模型组与ZGJTQGF给药组蛋白表达模式存在明显区分（图7A）；共鉴定得到2312种蛋白，筛选获得305个差异蛋白，其中162个上调、133个下调（图7B）。KEGG通路富集结果提示差异蛋白主要富集于AMPK信号通路、PPAR信号通路、胰岛素信号通路（图7C）。多组学联合分析，结果表明脂肪酸代谢、能量代谢、AMPKPPAR信号通路以及胆汁酸代谢是ZGJTQGF发挥药效的核心调控网络（图7D）。

图7. ZGJTQGF对db/db小鼠肝脏蛋白质组表达的影响

07.ZGJTQGF通过调控肝脏糖异生重编MASLD小鼠糖代谢

对各组小鼠肝脏组织进行Masson、PAS染色以及糖异生相关基因qPCR检测。Masson染色结果显示，模型组肝内胶原大量沉积，肝纤维化程度加重（图8A）；PAS染色结果显示，模型组肝细胞内糖原大量蓄积（图8B）。qPCR检测结果表明，模型组糖异生关键基因PEPCK、G6Pase、PCK1显著上调，葡萄糖转运基因GLUT2表达显著下降（图8CE）。ZGJTQGF干预后可减轻肝纤维化，减少肝内糖原蓄积，下调PEPCK、G6Pase、PCK1表达，上调GLUT2表达，抑制肝脏过度糖异生，恢复糖代谢稳态。

图8. ZGJTQGF对MASLD小鼠肝脏糖异生的影响

08.ZGJTQGF通过AMPK-PPARα轴调控脂质代谢、促进脂肪酸氧化

采用WB与qPCR检测小鼠肝脏AMPK-PGC1α-PPARα通路相关蛋白及基因表达水平。结果显示，模型组小鼠肝脏 p-AMPK 蛋白表达显著降低，脂质合成相关蛋白SREBP-1c、LXR-α、ACC、CEBPα、PPARγ表达显著升高，脂肪酸氧化相关蛋白PGC1α、PPARα、UCP表达显著下调（图9A-B）。经ZGJTQGF干预后，可有效激活AMPK信号，抑制脂质合成通路相关因子的异常高表达，同时上调脂肪酸β-氧化相关基因与蛋白水平（图9C-D），通过双向调控肝脏脂质代谢平衡，有效减少肝细胞脂质异常堆积。

图9. ZGJTQGF对MASLD小鼠AMPK-PGC-1α-PPAR信号通路及脂肪酸β-氧化的影响

09.ZGJTQGF促进AML-12细胞脂肪酸β氧化、调控脂质代谢重编程

采用棕榈酸诱导AML-12肝细胞构建脂质沉积体外模型，加入ZGJTQGF含药血清进行干预。油红O染色结果显示，模型组肝细胞内脂滴大量堆积，ZGJTQGF干预后可显著减少细胞内脂质沉积（图10A）。细胞脂质定量检测发现，模型组细胞内TG含量显著升高，ZGJTQGF干预后可有效降低细胞TG水平（图10B）。qPCR检测结果表明，模型组成脂相关基因SREBP-1c、LXR-α、ACC、FAS表达显著上调，脂肪酸氧化相关基因PGC1α、UCP1、FGF19、PRDM16表达显著下调（图10C-D）；而ZGJTQGF干预可显著抑制脂质合成基因的异常高表达，上调脂肪酸氧化关键基因水平。上述体外实验证实ZGJTQGF可通过调控脂质代谢重编程，促进肝细胞脂肪酸 β 氧化，缓解肝细胞脂毒性损伤。

图10. ZGJTQGF调控AML-12细胞中的脂质积累

10.ZGJTQGF调控3T3-L1细胞脂质代谢并诱导脂肪棕色化

采用MDI诱导3T3L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，给予ZGJTQGF含药血清进行干预。油红O染色结果显示，分化模型组细胞脂滴大量蓄积，ZGJTQGF干预后可明显抑制脂滴生成（图11A）；免疫荧光染色可见，ZGJTQGF干预可显著上调UCP1、PGC1α蛋白表达水平（图11BC）。qPCR检测结果表明，模型组成脂相关基因LPIN1、LPAATθ、DGAT1、SREBP1c显著上调，ZGJTQGF干预能够下调上述甘油三酯合成基因的表达（图11D）；同时可显著上调PRDM16、Cidea、UCP1、Tmem26、Cox7a1等棕色化生热基因（图11E）。以上结果提示，ZGJTQGF能够抑制白色脂肪细胞分化，诱导脂肪棕色化，增加细胞能量消耗。

图11. ZGJTQGF对3T3-L1细胞中脂肪生成及产热基因的影响

11.ZGJTQGF干预db/db小鼠肝脏蛋白组分析

开展靶标胆汁酸代谢组、WB及qPCR检测。PCA与PLSDA分析结果显示，模型组与ZGJTQGF给药组肝脏胆汁酸谱存在明显分离（图12A、12C）；模型组肝脏内结合型胆汁酸大量蓄积，ZGJTQGF干预后可显著升高熊去氧胆酸(UDCA)、脱氧胆酸(DCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)水平（图12D）。WB结果提示，ZGJTQGF可显著上调BSEP、ABCG8 蛋白表达（图12E）；qPCR检测表明，ZGJTQGF显著上调FXR基因表达，同时下调Ntcp、CYP7A1、HMGCOA 基因表达（图12F）。提示ZGJTQGF可通过FXRBSEP通路促进胆汁向外排泄，抑制胆汁酸与胆固醇的内源性合成，修复肝脏胆汁酸代谢紊乱。

图12. ZGJTQGF改善MASLD小鼠胆汁酸代谢紊乱

研究总结

本研究通过体内动物、体外细胞结合多组学技术探究ZGJTQGF治疗MASLD的作用机制。ZGJTQGF可改善db/db小鼠糖脂代谢紊乱、肝损伤及脂质蓄积；血清药物化学与网络药理学提示AMPK-PPAR-FXR为关键通路。多组学联合分析显示复方可重编程肝脏糖、脂肪酸及胆汁酸代谢；体内验证其抑制肝脏糖异生、促进脂肪酸β氧化，并调控FXRBSEP通路修复胆汁酸代谢紊乱。体外实验证实其可缓解肝细胞脂毒性，抑制白色脂肪分化并诱导脂肪棕色化。综上，ZGJTQGF通过多成分多靶点调控糖脂胆汁酸代谢网络发挥抗MASLD作用，为该复方应用提供实验支撑。