文章标题：Arginine restriction exploits DNMT3B–ASS1-driven arginine auxotrophy and mTORC1-suppressed autophagy to overcome niraparib resistance in ovarian cancer

发表期刊：Cancer Letters

影响因子：11.8

客户单位：武汉大学人民医院

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

卵巢癌被称作 “沉默的女性杀手”，早期几乎无典型症状，近七成患者确诊时已发展至晚期。过去晚期卵巢癌主要依靠铂类化疗治疗，但复发率居高不下。靶向药物尼拉帕利(Niraparib)作为PARP抑制剂，如今已成为卵巢癌一线及复发后维持治疗的核心药物，显著延长了患者生存期。但肿瘤细胞在药物持续作用下会产生获得性耐药，这是目前卵巢癌治疗的一大难题。

长久以来，学界解析尼拉帕利耐药多聚焦于基因异常与DNA修复通路，较少探究肿瘤代谢重编程、表观遗传调控与DNA修复三者的联动机制。耐药卵巢癌细胞会发生显著的氨基酸代谢重编程：细胞内源性精氨酸合成能力大幅下降，必须依赖外界摄取精氨酸才能存活。DNMT3B介导的ASS1基因表观遗传沉默是造成这一代谢特征的核心原因；同时耐药细胞内mTORC1通路持续异常激活，作为自噬的负向调控因子，该通路会导致细胞自噬功能受损，进一步加剧肿瘤的药物抵抗能力。

既往精氨酸剥夺疗法多联合放化疗使用，其与尼拉帕利联用的价值尚不明确。基于耐药细胞的精氨酸依赖这一代谢弱点，研究团队提出猜想：减少外源性精氨酸供给，能否抑制耐药肿瘤细胞、恢复尼拉帕利的抗肿瘤效果？为此，本研究围绕DNMT3B-ASS1分子轴、精氨酸代谢及mTORC1调控的自噬通路展开探究，阐明了卵巢癌尼拉帕利耐药的代谢与表观遗传分子机制，为耐药机制解析和新型联合治疗策略的研发提供了全新思路。

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研究结果

01.Niraparib获得性耐药的建立揭示以ASS1为核心的精氨酸代谢失衡

为探究卵巢癌Niraparib获得性耐药的生物学机制，研究采用长期梯度提升药物浓度的方式，构建了4株卵巢癌尼拉帕利耐药细胞系。相较于亲代细胞，耐药细胞对尼拉帕利敏感性大幅下降，同时对奥拉帕利、氟唑帕利等其他PARP抑制剂以及顺铂产生交叉耐药。

研究对四组亲代/耐药细胞配对样本开展转录组(RNA-seq)分析，发现细胞发生系统性代谢重编程。基因集富集分析（图1A-B）显示，耐药细胞中尿素循环、精氨酸代谢通路显著下调，而L-精氨酸跨膜转运通路明显上调，提示耐药细胞内源性精氨酸合成能力受损，转而依赖摄取胞外精氨酸维持生存。

研究进一步解析精氨酸代谢网络，鉴定出精氨琥珀酸合成酶1(ASS1)是该代谢网络的核心枢纽基因（图1D-E）。实验证实，耐药细胞中ASS1的mRNA与蛋白表达水平均降低；且ASS1的表达下调呈现药物浓度与作用时间依赖性，耐药性越强，ASS1表达水平越低（图1F-G）。

功能实验验证（图1H-K）：敲低亲代细胞的ASS1可诱导Niraparib耐药，在耐药细胞中恢复ASS1表达则能部分恢复药物敏感性。临床样本分析（图1L-N）显示，在接受Niraparib维持治疗的卵巢癌患者中，肿瘤组织ASS1低表达人群的无进展生存期(PFS)显著缩短。

综上，ASS1沉默介导的精氨酸营养缺陷表型是卵巢癌Niraparib获得性耐药的重要特征，ASS1可作为评估药物疗效与预后的潜在生物标志物。

图1.以ASS1为中心的精氨酸代谢在Niraparib耐药卵巢癌细胞中发生重编程

02.DNMT3B介导的启动子高甲基化通过沉默ASS1驱动Niraparib耐药表型

基于上述研究结果，证实DNA甲基化是导致ASS1持续沉默的主要原因，而非转录调控通路：转录因子HIF1A、MYC的表达变化无法解释ASS1的沉默规律；同时检测发现，耐药细胞的ASS1启动子CpG岛甲基化水平显著升高（图2A-C）。

通过转录组筛选甲基化相关基因发现，耐药细胞中甲基转移酶DNMT3B表达显著上调，去甲基化酶TET2、TET3表达则明显下降（图2D-G）。功能实验进一步证实：敲低DNMT3B，或过表达TET2、TET3，均能降低ASS1启动子甲基化水平，恢复ASS1的表达（图2H-M）。

功能验证实验显示，使用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-Aza)或敲低DNMT3B，均可有效恢复耐药细胞对Niraparib的药物敏感性（图2O-P）。临床样本分析结果：患者肿瘤组织中DNMT3B与ASS1表达呈负相关，DNMT3B高表达的患者对Niraparib治疗响应更差（图2Q-R）。此外，耐药细胞还存在IDH1表达下调、2-羟基丁酸(2-HB)含量上升等氧化还原代谢重塑现象。

综上，DNMT3B介导的ASS1启动子高甲基化是Niraparib耐药的核心表观驱动事件，细胞内由此形DNMT3B/ASS1/精氨酸相互作用的调控轴。

图2.DNMT3B介导的启动子甲基化驱动Niraparib耐药细胞中ASS1的沉默

03.Niraparib耐药细胞增强精氨酸跨膜转运，形成外源精氨酸依赖

本研究在明确ASS1启动子高甲基化、尿素循环通路受抑的基础上，解析了耐药细胞整体氨基酸代谢重编程特征。实验发现，尼拉帕利耐药细胞内瓜氨酸、鸟氨酸等精氨酸合成中间产物显著减少，但胞内精氨酸稳态并未被打破（图3A-C），提示细胞启动代偿通路。同位素示踪实验证实，耐药细胞的胞外精氨酸摄取能力大幅提升（图3D-E），细胞培养上清液中精氨酸浓度同步降低（图3F-G），证明细胞依靠强化外源摄取，补偿内源性精氨酸合成缺陷。

筛选精氨酸转运蛋白后可见：SLC7A6、SLC7A7、SLC7A9的mRNA与蛋白水平在耐药细胞中显著上调，且其表达变化与Niraparib的作用浓度、干预时间呈正相关（图3H-I）；氨基酸转运蛋白LAT1的活性也同步升高（图3J）。外源精氨酸依赖指数(ERI)分析进一步证明，耐药细胞高度依赖胞外精氨酸供给。

体内动物模型验证：长期给予Niraparib的荷瘤小鼠，血浆精氨酸水平逐渐下降，肿瘤组织内精氨酸含量先升高后降低；耐药肿瘤组织呈现SLC7A6/7/9高表达、ASS1低表达的特征（图3L-M）。临床队列数据显示：Niraparib维持治疗中，PFS＜12个月的耐药患者，血浆精氨酸在疾病进展前数月持续下降；PFS≥12个月的敏感患者，血浆水平保持稳定（图3N）。此外， LC-MS/MS与试剂盒两种方法交叉验证（图3O），证实血浆精氨酸检测结果真实可靠。

综上，Niraparib耐药细胞通过上调SLC家族转运蛋白、强化精氨酸跨膜摄取，重塑代谢网络并建立精氨酸依赖表型。血浆精氨酸动态变化可作为监测Niraparib获得性耐药的潜在无创生物标志物。

图3.Niraparib耐药的卵巢癌细胞通过增强外源性精氨酸摄取来维持胞内精氨酸水平

04.精氨酸剥夺抑制Niraparib耐药卵巢癌细胞增殖并诱导氧化应激及线粒体功能障碍

鉴于Niraparib耐药细胞依赖外源精氨酸的特性，研究开展体外精氨酸剥夺实验，探究其对耐药细胞的作用。结果表明，精氨酸剥夺显著抑制细胞增殖，诱导细胞发生G2期周期阻滞（图4A-D、4I-J），但无法诱发大量细胞凋亡（图4E、4K）；同时细胞氧化应激被显著激活，胞内活性氧、线粒体超氧化物水平逐步升高，线粒体膜电位持续下降（图4F-H、4L-M）。此外，精氨酸剥夺还会造成线粒体肿胀、内部嵴结构破坏等损伤（图4N）。简言之，体外剥夺外源精氨酸可有效阻滞Niraparib耐药细胞增殖、破坏线粒体功能，但不会直接杀伤细胞，仅造成非致死性细胞损伤。

图4.精氨酸剥夺抑制Niraparib耐药卵巢癌细胞增殖并诱导氧化应激及线粒体功能障碍

05.Niraparib联合精氨酸剥夺可加剧DNA损伤和氧化应激，逆转耐药

单独的精氨酸剥夺仅会引发非致死性代谢应激，联合Niraparib可产生明显的药物增敏作用。基于这一方向，研究开展了二者联用效应的探究，主要结果如下：

① 功能层面：联合治疗会显著加剧DNA损伤，补充精氨酸或过表达ASS1均可逆转该表型（图5A-B）。同时，联合治疗使ATR、CHK1磷酸化水平升高，PARP1的聚腺苷二磷酸核糖化(PARylation)水平下降，DNA修复功能受到抑制，剪切型caspase-3表达上调（图5C）。

② 细胞命运层面：相较于单纯精氨酸剥夺，联合治疗能更强地抑制细胞汇合度与增殖能力，诱导大量细胞凋亡，逆转耐药表型；同时进一步加剧线粒体膜电位(ΔΨm)丢失，促使总活性氧(ROS)与线粒体活性氧(mtROS)大量蓄积（图5D-H）。药效协同分析显示，高浓度Niraparib联合低精氨酸环境的协同作用最强（图5I-J）。

综上，在精氨酸剥夺造成的非致死性代谢应激基础上联用Niraparib，会放大DNA损伤、抑制DNA修复、加重线粒体功能障碍，最终实现显著增敏，部分逆转卵巢癌细胞的Niraparib耐药。

图5.Niraparib联合精氨酸剥夺可加剧DNA损伤和氧化应激，逆转耐药

06.mTORC1的过度活化驱动耐药并抑制自噬，削弱细胞对精氨酸剥夺的适应能力

自噬是细胞应对营养匮乏、药物损伤的重要保护机制。研究发现，Niraparib耐药细胞中ATG5、LC3等自噬核心蛋白表达偏低，基础状态下自噬囊泡数量更少；即便进行外源性精氨酸剥夺，耐药细胞也无法有效启动自噬，而亲本细胞可正常激活自噬流（图6A-D）。进一步机制解析可知，耐药细胞存在mTORC1通路持续过度活化（该通路是自噬的关键负调控因子），同时耐药细胞对胞外精氨酸的信号应答发生脱敏（图6E-G）。

采用依维莫司抑制mTORC1，或是利用基因技术敲低mTOR、Raptor，均可恢复耐药细胞的自噬功能，并恢复细胞对Niraparib的敏感性；但该操作会削弱精氨酸剥夺带来的协同抗肿瘤作用（图6H-L）。

研究构建小鼠皮下荷瘤模型开展体内验证（图6M-Q）。结果显示，Niraparib、精氨酸剥夺、依维莫司单药均能抑制肿瘤生长；Niraparib联合精氨酸剥夺的抑瘤效果最佳，在此基础上加用依维莫司后，整体疗效出现下降。此外，抑制mTORC1可恢复细胞自噬，同时使肿瘤、血浆及瘤周组织的精氨酸水平回升。

综上，mTORC1过度激活是Niraparib耐药、自噬功能受阻的核心诱因，同时决定了细胞对精氨酸剥夺的敏感程度；靶向mTORC1能够逆转耐药，但会抵消精氨酸限制带来的治疗获益。

图6.mTORC1过度活化将Niraparib耐药与自噬缺陷、精氨酸剥夺敏感性相关联

07.精氨酸剥夺扰乱能量与辅酶代谢，降低染色质可及性

为解析Niraparib联合精氨酸剥夺的增敏机制，研究开展靶标代谢组学分析（图7A）。结果显示，精氨酸剥夺可全面抑制多条核心代谢通路，造成 NAD(P)H、乙酰辅酶A储备耗竭，细胞氧化还原防御功能受损；同时胞内精氨酸、ATP、NADH等代谢物含量下降，细胞能荷降低，能量与辅酶代谢稳态被破坏（图7B-D）。由于NAD⁺是PARP酶的必需底物，其不足会直接阻断DNA损伤修复进程；乙酰辅酶A作为组蛋白乙酰化的原料，匮乏会引发乙酰化水平异常（图7E-F）。

结合ATAC-seq实验证实，精氨酸剥夺还会显著降低染色质可及性，使氧化应激、DNA修复相关基因的转录受到抑制（图7G-J）。Niraparib可进一步放大上述代谢与表观异常。

综上，联合干预通过代谢紊乱+表观重塑双重作用抑制DNA修复，形成代谢-表观-转录的连锁失衡，这也是联合方案放大DNA损伤、逆转卵巢癌Niraparib耐药的核心分子机制。

图7.Niraparib联合精氨酸剥夺疗法可重塑耐药性卵巢癌细胞的中心代谢、氧化还原平衡及乙酰辅酶A供应，并改变染色质可及性

08.精氨酸剥夺通过核乙酰辅酶A-组蛋白乙酰化轴，在染色质水平上限制DNA修复并增强应激

结合前期实验结果，研究最终锁定 “核乙酰辅酶A-组蛋白乙酰化轴”，进一步解析精氨酸剥夺对染色质功能的调控作用。结果显示，精氨酸剥夺会大幅降低耐药细胞胞质与细胞核内的乙酰辅酶A，进而下调H3K9ac、H3K27ac等组蛋白乙酰化修饰，补充精氨酸可有效逆转这一现象（图8A-D）。其次，DNA损伤区域乙酰化不足会阻碍染色质重塑，直接抑制DNA损伤修复进程（图8E）。同时，精氨酸剥夺造成全基因组H3K9ac水平整体下降，基因启动子区的改变最为显著（图8F-G）。最后，DNA修复相关基因的乙酰化修饰与表达同步受抑，氧化应激相关基因则被激活（图8H-J）。

综上，精氨酸剥夺通过乙酰辅酶A介导的组蛋白乙酰化修饰，在染色质层面抑制DNA修复、增强细胞应激应答。

图8.精氨酸调控乙酰辅酶A库与组蛋白乙酰化，重塑损伤-应激染色质图谱

09.50%精氨酸限制饮食联合Niraparib可安全有效抑制体内耐药卵巢肿瘤增殖

针对精氨酸剥夺可逆转卵巢癌细胞对Niraparib耐药的特性，研究开展体内饮食干预验证。通过100%、75%、50%、25%四组梯度饮食筛选，证实50%精氨酸限制饮食(50%ARD)可在保障安全性的同时，展现良好的抑瘤效果。

进一步研究证实，该饮食方案联合Niraparib可显著抑制耐药肿瘤生长（图9B、9E），实验动物耐受性良好（图9F-G）；联合干预可降低血浆、肿瘤及瘤周组织的精氨酸水平，上调DNA损伤标志物、下调组蛋白乙酰化水平，进而抑制肿瘤增殖、诱导细胞凋亡（图9H-L）。

此外，患者来源移植瘤(PDCX)模型（图9M、9P）、模拟临床不同维持治疗模式（图9Q、9X）均验证了该联合方案的有效性。配对喂养对照实验证实，抑瘤效应来源于精氨酸限制本身，而非热量差异；同时该饮食干预不会明显削弱机体抗肿瘤免疫。

综上，50%ARD安全性高、动物耐受性良好，可协同Niraparib抑制耐药卵巢肿瘤生长，是具备临床应用潜力的辅助治疗策略。

图9.精氨酸限制饮食安全耐受，并在多种体内耐药模型中增敏Niraparib

研究总结

本研究探究Niraparib耐药卵巢癌的代谢耐药机制与饮食干预方案。Niraparib长期暴露会上调DNMT3B，介导ASS1启动子甲基化沉默，导致细胞内源精氨酸合成减少；耐药细胞代偿上调精氨酸转运蛋白，形成精氨酸营养缺陷表型。

体外实验证实，mTORC1过度激活引发自噬受阻，使耐药细胞对精氨酸剥夺高度敏感。单纯精氨酸剥夺会造成线粒体功能异常、氧化应激与细胞周期阻滞；联合Niraparib可协同加剧DNA损伤，该作用依托于NAD(P)H与乙酰辅酶A耗竭、染色质可及性下降，进而阻断DNA修复通路，有效逆转耐药。抑制mTORC1虽可部分恢复药物敏感性，但会削弱精氨酸剥夺带来的协同增敏效果。

体内多种移植瘤模型验证，50%精氨酸限制饮食安全性佳，可协同Niraparib抑制耐药肿瘤增殖，且不会显著影响机体抗肿瘤免疫。

综上，本研究阐明了精氨酸代谢调控卵巢癌PARP抑制剂耐药的分子与表观机制，证实膳食精氨酸限制是具备转化潜力的临床辅助治疗策略。