文章标题：Deuterium modification of tyrosine kinase inhibitors contributes to reversing ferroptosis resistance through upregulation of aldehyde oxidase 1 in hepatocellular carcinoma
发表期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B
影响因子：14.6
客户单位：复旦大学附属华山医院
百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro
研究背景
肝癌临床治疗困境：超50%肝癌患者确诊时已达晚期，不可切除肝癌的系统治疗以酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs)为核心，但索拉非尼、瑞戈非尼等药物因肝癌的原发性铁死亡耐药，疗效受限。
铁死亡的抗肿瘤价值：铁死亡是铁依赖的、由细胞膜脂质过氧化物过载驱动的程序性细胞死亡，是有效的抗肿瘤机制，多个TKIs可诱导肝癌铁死亡，但肝癌的高度异质性使其产生铁死亡耐药，进而导致TKIs失效。
氘代药物的研发潜力：氘代修饰通过将分子特定位点的氢替换为氘，增强碳-氘键稳定性，提升药物疗效并降低毒副作用，吡啶作为TKIs的重要结构骨架，其氘代修饰的吡啶基三氘代甲酰胺衍生物已显示出抗肿瘤潜力，但具体作用机制亟待阐明。
研究结果
01.氘代TKIs通过诱导铁死亡逆转肝癌对TKIs的耐药
铁死亡耐药程度与TKIs耐受呈正相关，高耐药细胞对多种TKIs更不敏感（图1A）。在6株HCC细胞中，HCC-LM3、MHCC-97H、HepG2对常规TKIs耐药，而氘代索拉非尼与氘代瑞戈非尼可显著重敏化耐药细胞（图1B）。 氘代TKIs可上调Fe²⁺、MDA水平（图1C-1D），并抑制SLC7A11、NRF2等铁死亡防御蛋白（图1E）。GSEA显示氘代索拉非尼特异性激活铁死亡通路，对凋亡、自噬、坏死无明显影响（图1F）。 拯救实验证实仅铁死亡抑制剂可阻断氘代 TKIs 的杀伤作用（图1G-H）。体内实验表明氘代TKIs抗肿瘤效果更强，且安全性良好。
图1.TKIs的氘修饰通过促进肝细胞癌铁死亡逆转对TKIs的耐药性
02.AOX1是介导氘代TKIs诱导铁死亡的关键基因
通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)，研究人员鉴定出MEdarkgreen模块与索拉非尼响应性显著相关（图2A）。取该模块枢纽基因、应答/非应答患者差异基因、氘代索拉非尼/索拉非尼处理肿瘤差异基因三者交集，醛氧化酶1(AOX1)被筛选为介导氘代TKIs诱导铁死亡的核心基因（图2A）。
分子对接显示，氘代TKIs特征结构D₃-吡啶环与AOX1的结合能为−5.2597 kcal/mol，低于普通H₃-吡啶环（−5.0790 kcal/mol），提示结合力更强（图2E）。表面等离子体共振(SPR)进一步证实，D₃-吡啶环与AOX1的解离常数Kd=59.1 μmol/L，显著低于H₃-吡啶环（74.3 μmol/L）（图2F）。功能实验表明，D₃-吡啶环可剂量与时间依赖性上调AOX1，并增强细胞铁死亡敏感性（图2G–H）。
采用CRISPR/Cas9敲除AOX1后，氘代TKIs诱导的铁死亡被显著阻断，而原型TKIs作用不受影响（图3A–E）。上述结果证实：氘代TKIs依赖D₃-吡啶环介导AOX1上调来诱导铁死亡，该机制明显区别于原型药物。
图2.氘代TKI处理后AOX1赋予肝癌细胞差异化的铁死亡易感性
图3.氘代TKIs通过上调AOX1促进铁死亡
03.AOX1通过ACSL5介导的多不饱和脂肪酸(PUFAs)蓄积促进铁死亡
非靶标代谢组学分析显示，与索拉非尼组相比，氘代索拉非尼处理组肿瘤中多不饱和脂肪酸(PUFAs)显著富集，而PUFAs过度蓄积是铁死亡发生的核心驱动因素（图4A）。油红O染色证实，氘代索拉非尼可明显增加细胞内脂滴积累（图4B）。RNA Seq分析进一步表明，PUFAs合成相关基因在氘代索拉非尼组显著激活（图4C）。
整合转录组数据与qPCR验证发现，酰基辅酶A合成酶长链家族成员5(ACSL5)在氘代索拉非尼处理后显著上调（图4D）。相关性分析提示，ACSL5是AOX1的关键下游靶基因。定量脂质组学证实，AOX1通过ACSL5上调多种PUFAs的含量（图4F）。
功能挽救实验显示：
在AOX1过表达细胞中敲低ACSL5，可逆转脂滴蓄积、脂质过氧化及Fe²⁺升高，并恢复线粒体形态；
在AOX1敲除细胞中过表达ACSL5，可恢复细胞对铁死亡的敏感性；
在AOX1敲除细胞中回补ACSL5可显著恢复氘代TKIs诱导的铁死亡（图4G–I）。
图4. AOX1通过ACSL5介导的PUFAs积累促进铁死亡
04.AOX1通过抑制SIRT6介导的H3K9/H3K56去乙酰化激活ACSL5转录
AOX1是细胞内NAD⁺清除通路的关键酶（图5A）。功能实验证实，AOX1过表达显著降低肝癌细胞内NAD⁺水平，而敲低AOX1则使NAD⁺水平上升（图5B）。 SIRT6属于NAD⁺依赖性去乙酰化酶，可特异性催化组蛋白H3K9和H3K56位点去乙酰化；WB结果显示，AOX1过表达可抑制SIRT6表达，且该作用可被外源添加NAD⁺逆转（图5C）。
生物信息学预测显示，ACSL5启动子区域存在SIRT6结合位点（图5D）。ChIP qPCR与WB结果表明：
AOX1过表达使ACSL5启动子区域H3K9ac、H3K56ac水平显著升高，并上调ACSL5表达；
共表达SIRT6可逆转上述组蛋白高乙酰化状态，并抑制ACSL5转录（图5E）；
反之，敲低SIRT6可抵消AOX1沉默引起的H3K9/H3K56去乙酰化，恢复ACSL5转录（图5F）。
功能拯救实验进一步证实，敲低SIRT6可恢复AOX1敲除肝癌细胞对氘代TKIs的铁死亡响应，而同时抑制ACSL5则会消除该挽救效应（图5G）。上述结果表明：AOX1通过降低NAD⁺水平抑制SIRT6活性，减少H3K9/H3K56去乙酰化，进而促进ACSL5转录激活。
图5.AOX1可阻断SIRT6介导的H3K9和H3K56去乙酰化作用，从而促进ACSL5的转录
05.AOX1作为氘代TKIs疗效预测生物标志物
研究人员构建了不同AOX1表达水平的肝癌细胞系与小鼠皮下移植瘤模型。结果显示，低AOX1表达的肿瘤对氘代索拉非尼更为敏感，而索拉非尼的疗效不受AOX1表达水平影响（图6A–F）。免疫组化证实，氘代索拉非尼可显著上调低AOX1肿瘤中AOX1、ACSL5及4 HNE的表达（图6G）。
在人源肿瘤异种移植(PDX)模型中，与AOX1高表达肿瘤相比，AOX1低表达肿瘤对氘代索拉非尼响应更显著，表现为更强的肿瘤生长抑制作用（图7A–E）。
临床队列分析纳入50例接受氘代索拉非尼新辅助治疗的晚期肝癌患者，结果显示：AOX1低表达患者的客观缓解率显著高于AOX1高表达患者（图7F）；术后接受氘代索拉非尼辅助治疗的AOX1低表达患者，无复发生存期显著更长（图7G）。
上述结果证实，AOX1可作为预测氘代TKIs疗效的独立生物标志物，用于指导肝癌患者的精准用药。
图6.AOX1可作为生物标志物，用于评估氘代TKIs在肝癌细胞临床前模型中的疗效
图7.AOX1表达水平较低的肝细胞癌病例中，氘化索拉非尼的疗效更为显著
研究总结
本研究揭示了TKIs通过AOX1依赖的铁死亡通路逆转肝细胞癌耐药的新机制。氘代TKIs凭借其特有的D₃-吡啶环结构高亲和力结合并上调AOX1，进而通过ACSL5介导PUFAs蓄积，最终诱导铁死亡，这一通路与传统TKIs作用机制明显不同。
分子机制上，AOX1通过降低细胞内NAD⁺水平抑制SIRT6活性，减少其对ACSL5启动子区H3K9和H3K56的去乙酰化，从而促进ACSL5转录并增强铁死亡敏感性。临床研究证实，AOX1可作为氘代TKIs的疗效预测标志物，低表达AOX1的肝癌患者对氘代索拉非尼响应更佳。该研究不仅阐明了氘代TKIs的全新作用机制，也为晚期肝癌的精准治疗与抗肿瘤药物结构优化提供了重要理论与实践依据。
