英文标题：The regulatory effects of microbial community on the formation of higher alcohols and volatile flavor components in Hongqu rice wine brewing

发表期刊：Food Bioscience

影响因子：5.9

百趣提供服务：风味组学(VOCs)、短链脂肪酸高通量靶标定量、宏基因组测序

客户单位：福州大学

研究背景

红曲米酒作为中国传统发酵酒的典型代表，以糯米为原料、红曲为发酵剂。因红曲霉菌产生的色素、莫纳可林K等功能性次级代谢产物，兼具独特风味与潜在健康价值。然而，其传统酿造为开放非无菌环境，微生物群落复杂，易产生高级醇(higher alcohols, HAs)、生物胺(biogenic amines, BAs)、氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)、真菌毒素等有害代谢产物，这一问题严重制约红曲米酒产业的国际化与发展。 然而，迄今为止，红曲米酒酿造过程中HAs的形成同微生物群落的潜在关联，以及HAs代谢通路上的功能微生物和酶尚未完全阐明。本研究旨在探讨微生物群落在红曲米酒酿造过程中对挥发性风味特征的影响。首先，比较了低HA含量与高HA含量红曲米酒酿造过程中的挥发性风味特征；随后采用宏基因组测序技术从物种水平分析红曲米酒酿造过程中的微生物群落组成；进一步通过统计学分析揭示关键微生物物种与特征性挥发成分之间的潜在关联；最后基于生物信息学分析，鉴定出参与红曲米酒酿造过程中HA代谢及特征性挥发物生成的微生物酶及功能微生物。本研究不仅为深入理解红曲米酒酿造过程中HA代谢机制及特征性风味形成提供了科学依据，也为后续提升红曲米酒风味品质提供了方向指引。

研究概述

研究结论

01.红曲米酒酿造过程中HAs的动态变化

HHA与LHA的HAs积累趋势一致：发酵前期（1-10天）快速升高，10天后进入稳定期（图1A）。发酵结束时，HHA的总HAs含量（749.07±20.47 mg/L）显著高于LHA（407.61±20.80 mg/L），且两者均超过400 mg/L的阈值。与LHA相比，HHA的核心成分是异丁醇、异戊醇、苯乙醇（图1B-D），其中异戊醇含量最高（307.63±8.63 mg/L）。

图1.红曲米酒酿造过程中HAs的动态变化

02.红曲米酒酿造过程中理化参数的动态变化

还原糖、酒精和总酸的动态变化在一定程度上反映了红曲米酒的发酵状态和风味品质，也反映了发酵过程中微生物的生长和代谢状况。发酵开始，还原糖含量迅速增加，HHA 在发酵第2天达到峰值，LHA在第3天达峰，随后显著下降，发酵后期几乎耗尽（图2A）。随着还原糖的消耗，HHA和LHA中的酒精含量呈急剧上升趋势，最终HHA酒精浓度高于LHA（图2B）。 发酵前期总酸的含量显著升高，中后期趋于平稳甚至略有下降，最终LHA总酸达9.77 g/L，HHA总酸达8.39 g/L，均高于此前报道的红曲米酒总酸水平（图2C）。

图2.红曲米酒酿造过程中理化参数的动态变化

03.红曲米酒酿造中的微生物群落

HHA的优势属为Klebsiella，Cronobacter，unclassified_f_Enterobacteriaceae，Pantoea，Weissella，Enterobacter和Streptococcus；LHA则以Klebsiella，Pantoea，unclassified_f_Enterobacteriaceae，Leuconostoc，Lactobacillus，Lactococcus和Pediococcus为主（图3A）。已知大多数乳酸菌具有良好的产酸性能，乳酸菌的种类和丰度差别可能是导致HHA和LHA总酸差异的关键。在真菌属水平上，Saccharomyces，Aspergillus，Monascus，Millerozyma，Rhizopus和Cyberlindnera是红曲米酒酿造中最重要的6种真菌（图3B）。Monascus是LHA发酵的核心真菌属，发酵3天后，Saccharomyces占绝对优势。而HHA中Saccharomyces，Aspergillus，Millerozyma，Rhizopus和Cyberlindnera共同主导真菌菌群，Monascus丰度极低。

图3.两种红曲米酒传统酿造过程中优势微生物属相对丰度的堆叠直方图

在菌种水平上，HHA和LHA酿造在优势菌组成上有相当大的相似性。HHA的优势菌种包括：Klebsiella pneumoniae，Pantoea dispersa，Cronobacter sakazakii，Weissella paramesenteroides等；LHA则以Klebsiella pneumoniae，Pantoea dispersa，Leuconostoc  mesenteroides，Lactococcus lactis等菌为主（图4A）。HHA发酵前期以Aspergillus niger，Aspergillus oryzae，Rhizopus delemar等为主，3天后Saccharomyces cerevisiae成为绝对优势；LHA前期以Aspergillus niger，Monascus purpureus，Aspergillus oryzae等为主，3天后Saccharomyces cerevisiae占优（图4B）。

图4.两种红曲米酒传统酿造过程中优势微生物种相对丰度的堆叠直方图

通过Welsh’s t检验和Benjamini-Hochberg校正，明确了两种红曲米酒的物种水平的显著差异（图5A-B）。HHA中Cronobacter sakazakii，Weissella paramesenteroides，Klebsiella  pneumoniae等丰度更高；而LHA中Pantoea dispersa，Leuconostoc mesenteroides，Leuconostoc pseudomesenteroides等丰度显著更高。

图5.HHA与LHA的差异微生物物种分析

04.挥发性风味物质特征分析

VOCs的组成和含量是评价红曲米酒风味品质的重要指标之一，本研究鉴定了102种VOCs包括38种酯类、28种醇类、9种酸类、11种醛类、4种酮类、4种酚类及其他（图6A）：多数酯类（如庚酸乙酯、辛酸乙酯）和醇类（如1-庚醇、十二烷醇）在红曲米酒酿造过程中大量累积，尤其是中后期，在HHA中更为显著。酿造后期，LHA则富集苯乙酮、γ-辛内酯等特征风味物质。PCA分析显示（图6B），随发酵推进，HHA与LHA的挥发性成分逐渐分离，前期以2-庚酮、1-己醇等为特征成分，后期HHA以邻苯二甲酸二丁酯、正辛醇等为特征；LHA以戊酸乙酯、3-甲基-2-己醇等为特征（图6C）。层次聚类分析图显示（图6D），发酵早期两组样品挥发性特征相似，5天后两组差别明显，可清晰区分为组1和2。发酵45天的两组VOCs的差异倍数分析显示（图6E），多数成分在HHA组丰度更高，尤其酯类（乙酸乙酯、辛酸乙酯等）、醇类（正辛醇、异丁醇等）。此外，HHA中含LHA中几乎不存在的4-乙烯基愈创木酚（可能赋予木质风味，它被认为是一种独特的风味成分，增强了白酒的醇厚香气，并可能在推动群落结构的变化中发挥作用）。 而LHA中丰度更高的主要是戊酸乙酯、乳酸异戊酯等。

图6.两种红曲米酒传统酿造过程中挥发性风味成分的动态变化

05.关键微生物群落与特征挥发性成分之间的相关性

红曲米酒酿造过程中挥发性风味成分的形成，很大程度上取决于传统发酵工艺中微生物群落的特性，该过程涉及多种霉菌、酵母菌和细菌的共同作用。因此，为了阐明红曲米酒发酵过程中关键微生物类群与特征挥发性成分之间的潜在关联，研究人员对HHA和LHA组的特征微生物种类和差异VOCs做了Spearman相关性分析。结果显示，异丁醇、异戊醇与Streptococcus mutans、Streptococcus salivarius 、Weissella cibaria等细菌呈显著正相关，异戊醇与泛菌属呈显著负相关（图7A）；癸醛、1-辛烯-3-醇等风味物质与Wickerhamomyces ciferrii, Candida vartiovaarae、Yamadazyma tenuis等真菌显著正相关（图7B）。上述分析结果显示，可通过增强功能性微生物发酵，促进红曲米酒酿造中特征性VOCs的生成，同时降低高级醇含量，从而提升整体风味品质。

图7.关键微生物物种与特征挥发性成分的相关性热图

06.HAs代谢相关的功能基因和微生物

根据KEGG数据库及相关文献，挖掘了参与HAs及特征风味成分代谢的酶。气泡图显示（图8），HHA与LHA中苯乙醇生物合成相关基因的丰度存在显著差异，如醛脱氢酶、丙酮酸脱羧酶。部分酶同HAs的合成直接相关，如编码可直接催化苯乙醛生成苯乙醇的芳基醇脱氢酶的基因，Klebsiella variicola、Pediococcus  pentosaceus和Lactobacillus vaccinostercus等菌被视为主要贡献者。苯乙醛脱氢酶在促进苯乙醛降解过程中发挥关键作用，Klebsiella pneumoniae、Klebsiella quasipneumoniae、Klebsiella variicola等菌是主要贡献者。几种与糖酵解相关的酶，包括支链淀粉1,6-葡萄糖苷酶和葡萄糖淀粉酶，促进HHA中葡萄糖的显著积累，从而推动了HHA酿造过程中HAs的生成。编码支链淀粉1,6-葡萄糖苷酶的基因存在于多种微生物中，包括Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus niger、Aspergillus flavus、Millerozyma farinosa和Aspergillus flavus。葡萄糖淀粉酶由多种微生物共同编码，包括Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus niger、Millerozyma farinosa、Aspergillus flavus、Rhizopus delemar和Cyberlindnera fabianii。此外，基因功能注释还揭示了参与红曲米酒中挥发性风味化合物（酯类、醇类、羧酸和醛类）代谢的酶类。对于酯类物质，其合成主要通过酯酶和醇酰基转移酶的可逆催化作用实现。GC-MS结果显示，挥发性成分中的有机酸也是红曲米酒重要的特征风味（图6E）。作为酯类形成的重要前体，有机酸可在酯酶催化下与醇类反应生成酯类芳香成分，从而影响酒类特征香气与风味风格的形成。在HHA酿造过程中，编码脂肪酸合成酶的基因显著富集，这促进了HHA酿造中更多挥发性有机酸的积累。

图8.HAs代谢相关酶的基因丰度气泡图

07.特征挥发性风味物质代谢途径网络

通过KEGG代谢通路数据库构建了HAs、酯类、脂肪酸等关键风味化合物的代谢网络（图9），清晰揭示了红曲米酿造过程中特征挥发性风味成分的形成代谢途径及其微生物调控机制。

图9.特征挥发性风味物质代谢途径网络

研究总结

研究采用宏基因组技术在种水平系统解析红曲米酒的微生物群落结构与功能，并联合靶标代谢组学和风味组学填补了红曲米酒微生物-风味-HAs关联研究的空白；揭示了红曲米酒酿造过程中HAs及挥发性风味成分代谢相关的微生物酶，为提升红曲米酒风味品质提供了重要科学依据，为产业的健康发展奠定了坚实基础。