文章标题：Gut microbiota-derived L-theanine promotes host branched-chain amino acid catabolism

发表期刊：nature microbiology

影响因子：19.4

客户单位：华南农业大学

百趣提供服务：非靶标代谢流、新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

支链氨基酸(Branched-chain amino acids, BCAA)包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，作为必需氨基酸，适量水平对肌肉生长、蛋白质合成及延缓衰老具有重要作用，但血清BCAA水平升高与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病等多种代谢紊乱密切相关，因此调控BCAA水平对宿主健康和疾病管理至关重要。BCAA水平受激素调节、营养状态等内源性因素影响，肠道菌群也可通过合成或降解BCAA直接调节胃肠道腔中BCAA水平，但肠道菌群对宿主内在BCAA代谢的调控作用及机制仍不明确。

肠道菌群在宿主屏障功能维持、免疫系统调节及代谢调控中发挥多方面作用，其调控宿主氨基酸代谢的机制包括激活信号通路、产生代谢产物及释放胞外囊泡等，但肠道菌群如何影响宿主BCAA代谢的具体机制尚未阐明。L-茶氨酸作为一种特殊氨基酸，已被证实可在人体组织中检测到，口服后具有缓解压力和焦虑等生理功能，且已有研究表明细菌来源的谷氨酰胺合成酶与茶树叶中L-茶氨酸合成酶具有同源性，推测细菌可能具备合成L-茶氨酸的能力。基于此，本研究通过比较无菌(GF)与无特定病原体(SPF)动物的代谢组和肠道菌群，探究肠道菌群调控宿主BCAA代谢的间接机制，明确关键菌株及代谢产物，为BCAA相关代谢紊乱疾病的治疗提供新方向。

研究结论

01.肠道菌群调控宿主BCAA水平

对比SPF和GF猪的BCAA水平发现，GF猪的盲肠、结肠、血清等多数组织和体液中BCAA含量显著高于SPF猪（图1a-c）；在GF小鼠模型中，十二指肠、结肠及血清中的BCAA水平同样显著升高（图1d-f）。抗生素处理实验显示，氨苄西林或黏菌素处理可升高小鼠血清BCAA水平（图1g），青霉素处理小鼠在停药3周后血清BCAA水平仍维持升高状态（图1h）。共饲养实验中，氨苄西林处理组与对照组小鼠共饲养7天后，血清BCAA水平趋于一致（图2a-b）；FMT实验显示，接受对照组粪便移植后，氨苄西林处理组小鼠血清BCAA水平升高的现象被逆转（图2c-d），抗生素鸡尾酒预处理小鼠接受不同供体FMT后，其血清BCAA水平与供体小鼠呈现相似模式（图2e），上述结果证实肠道菌群可显著调控宿主血清BCAA水平。

图1.肠道微生物群影响宿主BCAA水平

图2.血清BCAA水平受FMT调控

02.乳酸杆菌负向调控宿主血清BCAA水平

LEfSe分析显示，氨苄西林处理后雌性小鼠肠道中乳酸杆菌属为关键差异菌属，其中鼠乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的相对丰度显著降低（图 3a），且雄性小鼠中也观察到类似趋势。相关性分析表明，这四种乳酸杆菌的丰度与血清BCAA水平呈显著负相关（图3b）。单菌株定植实验显示，在抗生素预处理小鼠中，罗伊氏乳杆菌、鼠乳杆菌和肠乳杆菌定植均能降低血清缬氨酸水平（图3c-d），罗伊氏乳杆菌定植还可降低结肠中亮氨酸和异亮氨酸水平；在GF小鼠中，罗伊氏乳杆菌或鼠乳杆菌定植能显著降低血清BCAA水平（图3e），且在未经过抗生素预处理的SPF小鼠中，长期定植罗伊氏乳杆菌也可下调血清BCAA水平，而大肠杆菌MG1655定植对血清BCAA水平无显著影响证实乳酸杆菌（尤其是罗伊氏乳杆菌）可特异性负向调控宿主血清BCAA水平。

图3.乳酸菌降低血清支链氨基酸水平

03.罗伊氏乳杆菌通过代谢产物促进BCAA分解代谢

体外培养实验发现，罗伊氏乳杆菌、肠乳杆菌和鼠乳杆菌的培养上清液中BCAA水平随培养时间延长而升高（图4a），表明乳酸杆菌并非通过直接利用BCAA降低宿主BCAA水平。将罗伊氏乳杆菌培养上清液与IPEC-J2细胞共培养，结果显示细胞内BCAA水平显著降低（图4b），且罗伊氏乳杆菌代谢产物可上调BCAA转运体(SLC7A9、SLC1A5)的mRNA表达（图4c），增强犬尿氨酸摄取能力（图4d），排除BCAA转运减少导致细胞内BCAA水平降低的可能；同时，罗伊氏乳杆菌代谢产物对细胞内甘油三酯浓度及脂质代谢相关基因表达无显著影响，但能显著增强BCAA分解代谢关键酶BCAT1和BCAT2的mRNA和蛋白表达（图4f-g），且不影响BCKDHA、BCKDHB及BCKDK的表达（图4f）。进一步检测发现，罗伊氏乳杆菌代谢产物处理后，IPEC-J2细胞内BCAA分解代谢产物水平显著升高（图4h），且BCAT特异性抑制剂(R)-2HG可阻断罗伊氏乳杆菌代谢产物对BCAA分解代谢的促进作用，证实罗伊氏乳杆菌通过代谢产物促进宿主BCAA分解代谢。

图4.乳酸乳杆菌衍生的代谢物促进支链氨基酸分解代谢

04.罗伊氏乳杆菌来源L-茶氨酸是调控BCAA代谢的关键产物

非靶标代谢组学分析罗伊氏乳杆菌与对照菌株F7的培养上清液，筛选出10种差异代谢产物（图5a），体外细胞实验验证发现，仅L-茶氨酸能模拟罗伊氏乳杆菌代谢产物的作用，显著上调BCAT1和BCAT2的mRNA和蛋白表达（图5b-c）。靶标代谢检测显示，GF猪回肠、盲肠内容物、粪便等组织和体液中L-茶氨酸水平显著低于SPF猪，GF小鼠血清中L-茶氨酸水平也显著下调，且罗伊氏乳杆菌、肠乳杆菌和鼠乳杆菌的培养上清液中L-茶氨酸水平随培养时间延长而升高，大肠杆菌MG1655培养上清液中未检测到L-茶氨酸。体外细胞实验显示，200 μM L-茶氨酸处理可降低IPEC-J2细胞内BCAA水平，升高BCKA、酰基肉碱及乙酰辅酶A水平（图5d-e），13C标记实验证实L-茶氨酸可促进BCAA分解代谢（图5f）；体内实验中，300 mg/kg的L-茶氨酸灌胃小鼠14天后，空肠和肌肉中BCATs的mRNA和蛋白表达及活性显著升高（图5g），血清BCAA水平显著降低且与L-茶氨酸水平呈负相关（图5h），血清BCKA和酰基肉碱水平显著升高（图5i-j）。罗伊氏乳杆菌glnA基因敲除实验显示，ΔglnA菌株的L-茶氨酸合成能力显著下降，且定植ΔglnA菌株的小鼠血清BCAA和BCKA水平无显著变化（图5k），证实罗伊氏乳杆菌来源的L-茶氨酸是促进宿主BCAA分解代谢的关键产物。

图5.来源于乳酸杆菌的L-茶氨酸促进支链氨基酸的分解代谢

05.L-茶氨酸通过抑制组蛋白甲基化促进BCAT2 mRNA表达

Western blot分析显示，L-茶氨酸处理可下调IPEC-J2细胞中抑制性组蛋白甲基化标记(H3K9me3、H3K27me3、H3K4me1)的丰度（图6a），且在人CaCo-2细胞中呈现类似调控模式（图6b-c）。ChIP-qPCR实验证实，L-茶氨酸可降低BCAT2启动子区域H3K27me3和H3K9me3修饰水平，以及BCAT1启动子区域H3K9me3修饰水平（图6d）。进一步研究发现，L-茶氨酸处理可降低IPEC-J2细胞中蛋氨酸水平，升高S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-Met, SAM)水平，同时抑制H3K27组蛋白甲基转移酶(Histone methyltransferase, HMT)活性（图6e），下调EZH1和EZH2（H3K27me3修饰关键酶）的蛋白表达（图6f）。抑制剂实验显示，H3K27me3抑制剂(UNC1999)或Chaetocin可阻断L-茶氨酸对BCATs mRNA表达的调控作用（图6g），且L-茶氨酸可降低IPEC-J2细胞中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5-mC)水平、BCAT2基因DNA甲基化水平及DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)活性，DNMT抑制剂（阿扎胞苷）可阻断L-茶氨酸对BCAT2 mRNA表达的促进作用，证实L-茶氨酸通过抑制BCAT2的H3K27me3修饰和DNA甲基化，促进其mRNA表达。

图6.L-茶氨酸通过抑制BCATs的组蛋白甲基化和泛素化，促进其mRNA和蛋白质表达

06.L-茶氨酸通过抑制泛素化稳定BCAT2蛋白

蛋白酶体抑制剂(MG132)和蛋白质合成抑制剂(CHX)实验显示，L-茶氨酸对BCATs蛋白丰度的提升作用可被MG132或CHX阻断（图6h），免疫共沉淀实验证实 L-茶氨酸可降低BCAT2的泛素化水平（图6i）。通过PhosphoSitePlus和Uniprot数据库预测并验证，BCAT2的230、247、378位赖氨酸残基为高度保守的潜在泛素化位点，在293T细胞中过表达野生型(WT)BCAT2及K230R、K247R、K378R突变体发现，L-茶氨酸可降低WT BCAT2的泛素化水平，但对三种突变体的泛素化无显著影响，证实L-茶氨酸通过抑制BCAT2在230、247、378位赖氨酸残基的泛素化，增强其蛋白稳定性。

研究总结

本研究通过多层面实验证实，肠道菌群可通过间接机制调控宿主BCAA代谢，明确罗伊氏乳杆菌是关键功能菌株，其产生的L-茶氨酸是促进宿主BCAA分解代谢的核心代谢产物。具体机制为：L-茶氨酸一方面通过抑制BCAT2基因的H3K27me3修饰和DNA甲基化，促进其mRNA转录；另一方面通过抑制BCAT2蛋白230、247、378位赖氨酸残基的泛素化修饰，增强蛋白稳定性，从而上调BCAT2的表达和活性，加速BCAA分解代谢，降低宿主血清BCAA水平。此外，罗伊氏乳杆菌中glnA基因对L-茶氨酸的合成至关重要，敲除该基因后菌株丧失调控宿主BCAA代谢的能力。本研究首次揭示了肠道菌群通过代谢产物调控宿主BCAA代谢的间接机制，明确L-茶氨酸作为关键调控分子，为肥胖、胰岛素抵抗等BCAA相关代谢紊乱疾病的治疗提供了新的靶点和思路，也为益生菌制剂的开发和应用奠定了理论基础。