文章标题：Microbiota-indole-3-propionic acid-heart axis mediates the protection of leflunomide against αPD1-induced cardiotoxicity in mice

发表期刊：nature communications

影响因子：15.7

客户单位：武汉大学人民医院

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro、微生物16S扩增子测序、600MRM（现已升级为AQ700）

研究背景

黑色素瘤是一种高死亡率的恶性皮肤癌，近年来，免疫检查点抑制剂（如 αPD1）在黑色素瘤治疗中取得显著成效，但伴随严重的心脏毒性，如心肌炎和心肌病。尽管已有研究探索减轻心脏毒性的方法，但可能削弱 αPD1 的抗肿瘤效果。

来氟米特（Leflunomide, Lef）是一种临床用于治疗类风湿关节炎的免疫调节药物，可抑制肿瘤生长并减轻心脏重塑，但其对 αPD1 诱导的心脏毒性的作用尚不清楚。

本研究旨在探讨 Lef 对 αPD1 诱导的小鼠心脏毒性的保护作用及其潜在机制。

研究成果

01——Lef 治疗增强了 αPD1 介导的对黑色素瘤的免疫治疗疗效

为了研究 Lef 对 PD-1 抑制剂抗肿瘤特性的影响，研究人员将 B16-F10 细胞皮下移植到小鼠右侧腹部，并在小鼠腹腔注射 αPD1 或 IgG，同时给予 Lef 治疗 12 天（图 1A）。

结果显示，αPD1 治疗显著减小了肿瘤体积，而 αPD1 联合 Lef 治疗进一步降低了肿瘤体积（图 1B-C）。

此外，从肿瘤移植后 14 天开始，每隔一天给予小鼠 αPD1 腹腔注射，并在首次注射时开始每日 Lef 治疗，观察到 Lef 对黑色素瘤体积有显著的治疗效果。延长肿瘤接种时间至 45 天后，发现 αPD1 治疗降低了黑色素瘤小鼠的死亡率，且 Lef 增强了这种治疗效果。

流式细胞术分析显示，与对照组相比，αPD1 治疗增加了小鼠肿瘤组织中的 CD4+ 和 CD8+T 细胞数量，而 Lef 显著降低了 CD8+T 细胞数量，但不影响 CD4+T 细胞（图 1D）。

研究还发现，Lef 减少了 αPD1 处理小鼠的肿瘤增殖，但不影响肿瘤死亡，表明 Lef 增强了 αPD1 的抗肿瘤作用。

图1. Lef 增强了 αPD1 介导的对黑色素瘤的免疫治疗疗效

02——Lef 治疗减轻 αPD1 治疗的黑色素瘤小鼠的心脏毒性

αPD1 处理的黑色素瘤小鼠出现心功能受损，表现为射血分数（Ejection Fraction, EF）和短轴缩短分数（Fractional Shortening, FS）降低以及左心室舒张末期内径（Left Ventricular End-diastolic Internal Diameter, LVIDd）增加。Lef 治疗可预防这些病理改变，并改善心输出量（Cardiac Output, CO）（图 2A-D）。

整体纵向应变（Global Longitudinal Strain, GLS）和平均径向应变（Average Radial Strain, ARS）分析显示，Lef 可改善 αPD1 小鼠左心室功能（图 2E-G）。Lef 还减轻了 αPD1 诱导的心脏损伤，表现为降低的心肌肌钙蛋白 T（cTnT）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平。

RNA 测序揭示 αPD1 组与 αPD1+Lef 组间存在 2490 个基因表达改变，其中差异表达基因（DEG）参与的 PI3K-AKT 信号通路等与组织保护相关（图 3A-B）。

进一步研究发现，Lef 减少了 αPD1 诱导的心脏组织中 CD8+T 细胞浸润，降低了促凋亡蛋白 Bax 的表达，增加了抗凋亡蛋白 Bcl2 的表达，显著抑制了 αPD1 诱导的心肌细胞凋亡（图 3C-E）。

图2. Lef 减轻 αPD1 治疗的黑色素瘤小鼠的心脏毒性

图3. Lef 有效抑制 PD1 抑制剂诱导的小鼠心肌细胞凋亡

03——Lef 对 αPD1 小鼠的心脏保护作用不依赖于 T 细胞

为了探究 CD8+T 细胞是否参与 Lef 对 αPD1 小鼠的心脏保护作用，研究者采用 CD8 单克隆抗体对 αPD1 处理的黑色素瘤小鼠进行 CD8+T 细胞耗竭实验。

免疫荧光检测证实 CD8+T 细胞已在心脏中有效耗竭，实验结果显示，即使在 CD8+T 细胞被耗竭的情况下，Lef 依然能够减轻 αPD1 治疗小鼠的心脏损伤和心功能障碍，表现为改善的 EF、FS，以及降低的 BNP mRNA 水平和 cTnT 浓度。

此外，研究还发现 Lef 的活性代谢产物 A77 1726 对分离自 αPD1 处理小鼠的成年心肌细胞活力无显著影响，表明 Lef 的心脏保护作用并非通过直接作用于心肌细胞或依赖 CD8+T 细胞实现。

04——Lef 治疗减轻 αPD1 小鼠肠屏障损伤，其心脏保护作用依赖肠道微生物群

研究者研究了 Lef 对 αPD1 治疗的黑色素瘤小鼠肠道损伤的保护作用，发现 Lef 可逆转 αPD1 引起的结肠缩短、肠绒毛丢失和杯状细胞减少，并增加紧密连接蛋白 occludin 和 ZO-1 的表达。

为验证 Lef 的心脏保护作用是否依赖肠道微生物群，研究者进行了粪菌移植（Fecal Microbiota Transplantation, FMT）实验（图 4A）。

结果显示，接受 αPD1+Lef 小鼠粪菌移植的小鼠，相比接受 αPD1 小鼠粪菌移植的小鼠，表现出更好的心脏功能（图 4B-D），且 BNP mRNA 水平（图 4E）和 cTnT 浓度（图 4F）更低，心肌细胞凋亡显著减少（图 4G），证实 Lef 的心脏保护作用是微生物群依赖性的。

图4. Lef 改善 PD1 抑制剂诱导的小鼠肠屏障功能障碍和粪便移植的效果

05——Lef 治疗改变了 αPD1 治疗的黑色素瘤小鼠的肠道微生物丰度和群落结构

研究者通过 16S rRNA 测序分析了 Lef 对 αPD1 治疗的黑色素瘤小鼠肠道微生物组的影响，测序稀释曲线的 Goods coverage 指数显示测序深度充足（图 5A）。结果显示，αPD1+Lef 处理显著改变了肠道微生物群的 α 多样性（图 5B）和 β 多样性（图 5C）。

与对照组相比，αPD1 小鼠的厚壁菌门（Firmicutes）丰度显著降低，拟杆菌门（Bacteroidota）丰度明显增加（图 5D），属水平菌群丰度也呈现特征性变化，Sankey 图直观展示了各组间菌群分布的动态迁移（图 5E）。

Lefse 分析发现，αPD1 和 αPD1+Lef 组间存在显著的分类学差异，涉及副枝杆菌属（Paramuribaculum）、颤螺菌科（Oscillospiraceae）和乳杆菌属（Lactobacillus）等细菌（图 5F）。

进一步的相关性分析表明，这些特征细菌与心脏功能变化密切相关（图 5G）。

图5. Lef 治疗改变了 PD1 抑制剂治疗小鼠的肠道微生物丰度和群落结构

06——IPA 对 αPD1 处理的黑色素瘤小鼠的心脏毒性保护作用

研究者检测了小鼠血浆样本，发现脂质、有机酸及其衍生物和有机杂环化合物是主要的代谢物类别（图 6A）。

代谢物水平在不同组间存在显著差异，αPD1 组与对照组相比有 39 种代谢物差异（图 6B），而 αPD1 与 αPD1+Lef 组之间有 65 种代谢物显著改变（图 6C）。

代谢通路分析强调了色氨酸途径的重要性（图 6D）。通过色氨酸缺乏饲料实验，证实了色氨酸在 Lef 介导的心脏保护中的必要性——色氨酸缺失时，Lef 无法减轻 αPD1 诱导的心脏毒性（图 6E-F）。

16S rRNA 测序和代谢组学交叉分析揭示了 Lef 处理可逆转的 11 个差异属和 12 个差异代谢物的相关性（图 6G），其中吲哚-3-丙酸（IPA）作为唯一的色氨酸相关代谢物，与副枝杆菌属（Paramuribaculum）负相关，并在 αPD1+Lef 组中显著上调。

粪菌移植实验表明，接受 αPD1+Lef 小鼠微生物群移植的小鼠血浆 IPA 水平显著增加（图 6H）。

进一步的 IPA 补充实验（图 6I）显示，IPA 改善了 αPD1 治疗小鼠的心脏功能（图 6J），降低了 BNP mRNA（图 6K）和 cTnT 水平（图 6L），并抑制了心脏细胞凋亡。

图6. IPA 对 αPD1 处理的黑色素瘤小鼠的心脏毒性保护作用

07——IPA 通过与 AhR 的配体结合促进心脏中 PI3K 的表达

孕烷 X 受体（Pregnane X Receptor, PXR）和芳香烃受体（Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR）是两种 IPA 受体（图 7A）。心脏中不存在 PXR，而研究表明 AhR 在心血管疾病中起重要作用。

Western blot 结果显示，αPD1 抑制 AhR 及其靶基因细胞色素 P450 1A1（CYP1A1）的表达，而 IPA 则促进它们的表达，表明 IPA 处理的小鼠 AhR 活化状态增加（图 7A）。

为了研究 AhR 在 IPA 介导的 αPD1 诱导的心脏毒性保护中的作用，研究者用 shAhR 转染 αPD1 小鼠（图 7B），发现心脏 AhR 缺乏几乎消除了 IPA 的保护作用，导致射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）降低，BNP mRNA 和 cTnT 水平升高（图 7C-F）。

此外，从 αPD1 处理的黑色素瘤小鼠中分离的成年心肌细胞实验表明，AhR 抑制剂 CH223191，而非 PXR 抑制剂白藜芦醇或 TLR4 抑制剂 IAXO-102，消除了 IPA 对 αPD1 诱导的心肌细胞损失的保护作用。

图7. IPA 通过 AhR 受体影响心脏毒性

为了揭示 IPA 的下游通路并更广泛地了解其对 αPD1 诱导的心脏毒性的影响，研究者对 RNA-seq 数据进行了 KEGG 通路分析。结果显示，PI3K-AKT 信号通路是最显著改变的通路。

研究发现，AhR 作为转录因子，通过特异性结合靶基因的 C(T)GCGTG 基序来发挥作用，且在 PI3K 催化亚基 α（Pik3ca）的启动子位点中鉴定到一个 AhR 结合位点（图 8A）。

ChIP-PCR 实验进一步证实，AhR 可直接结合 PI3K 催化亚基 α 的启动子区域（图 8B）。在 αPD1 处理的黑色素瘤小鼠中，PI3K 催化亚基 α mRNA 水平降低，而 Lef 或 IPA 补充使 IgG 或 αPD1 处理的黑色素瘤小鼠中的 PI3K 催化亚基 α mRNA 显著上调（图 8C-D）。

此外，Lef 或 IPA 补充还显著上调了总 PI3K 和磷酸化 PI3K（p-PI3K）的水平（图 8E）。PI3K 信号通路的下游组分，包括磷酸化 AKT（p-AKT）和磷酸化糖原合成酶激酶 3β（p-GSK3β），在 αPD1 处理的黑色素瘤小鼠的心脏中减少，而这些病理改变可通过 Lef 或 IPA 补充来预防（图 8E）。

为了建立 PI3K 与心肌细胞损失之间的因果关系，研究者对分离的心肌细胞进行了 PI3K 功能丧失实验。结果发现，PI3K 缺乏几乎消除了 IPA 对体外细胞活力的保护作用（图 8F）。这表明 PI3K 在 IPA 介导的心脏保护作用中起着关键作用。

图8. IPA 通过心脏中 AhR 的配体结合促进 PI3K 的表达

研究总结

αPD1 免疫检查点阻断剂常联合其他疗法用于癌症治疗，但该治疗方案会引发心血管毒性。

研究发现，来氟米特（Lef）治疗可抑制 αPD1 相关的心脏毒性，且不影响 αPD1 介导的免疫治疗疗效。

具体而言，Lef 能改变 αPD1 治疗的黑色素瘤小鼠肠道微生物群的群落结构——与接受 αPD1 治疗小鼠微生物群移植的小鼠相比，接受 Lef+αPD1 治疗小鼠微生物群移植的小鼠具有更好的心脏功能。

从机制来看，作者通过代谢组学分析鉴定出吲哚-3-丙酸（IPA），该物质可保护 αPD1 治疗小鼠的心脏功能。IPA 能直接与芳香烃受体（AhR）结合，进而促进 PI3K 的表达，最终抑制心肌细胞凋亡，减轻免疫损伤引发的心脏毒性。

上述结果表明，Lef 通过调节微生物群-PA-心脏轴，有效减轻 αPD1 诱导的黑色素瘤小鼠心脏毒性。

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