文章标题：Proteomics of urinary exosomes for discovering novel non-invasive biomarkers of acute myocardial infarction patients

发表期刊：International Journal of Biological Macromolecules

影响因子：8.5

研究背景

急性心肌梗死（AMI）是全球范围内导致死亡和发病的主要原因，其发病突然，进展迅速，及时准确的早期诊断对改善患者预后至关重要。

目前临床上主要依赖血清心肌肌钙蛋白等生物标志物进行诊断，但这类检测存在明显局限性：一方面，肾功能不全患者的高敏心肌肌钙蛋白水平可能异常升高，干扰诊断结果；另一方面，血清检测属于有创操作，且传统血液生化检查和冠状动脉造影的敏感性有限、存在较高误诊率。

外泌体作为包裹信息分子的胞外囊泡，已被证实参与急性冠脉综合征（ACS）的病理生理过程，其携带的蛋白质、核酸等分子有望成为疾病生物标志物。尿液作为一种无创采集的体液，具有获取便捷、蛋白质稳定性高、样本量大等优势，但其来源的外泌体在 AMI 诊断中的应用尚未得到充分探索。

此前尚无研究明确 AMI 患者尿液外泌体中的特异性蛋白质标志物，且传统外泌体分离方法（如超速离心、体积排阻色谱法）存在纯度低、处理量受限等问题。

因此，本研究采用高效的 EXODUS 分离系统，结合蛋白质组学技术，旨在挖掘 AMI 患者尿液外泌体中的潜在无创生物标志物。

研究结果

本研究通过 EXODUS 系统分离 AMI 患者与健康对照者的尿液外泌体，经多维度表征、蛋白质组学分析及生物信息学验证，获得以下核心结果，各结果对应研究中的关键图表数据：

01-研究设计与样本处理

研究纳入 3 例 AMI 患者和 3 例健康对照者，首先通过心电图明确两组研究对象的临床诊断结果（图 1A），随后采集两组的清晨尿液样本（图 1B），经离心、过滤预处理后，采用 EXODUS 系统分离尿液外泌体（图 1C），再通过超滤管对分离得到的外泌体进行浓缩以满足后续实验需求（图 1D），之后对两组样本的外泌体蛋白质进行分析（图 1E），最后通过生物信息学分析挖掘两组间的潜在蛋白质生物标志物（图 1F），形成了完整且严谨的“样本采集-外泌体分离-蛋白质鉴定-标志物筛选”技术流程。

图1. 外泌体蛋白作为急性心肌梗死生物标志物的潜力研究

02-尿液外泌体的表征结果

纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，分离的外泌体呈单峰分布，峰值集中在 105 nm，主要粒径范围为 80-180 nm，符合外泌体典型尺寸特征（图 2A）；AMI 组与健康对照组的外泌体平均粒径和众数粒径无显著差异（图 2B），但 AMI 组的外泌体颗粒数量显著高于健康对照组（图 2C）。

Western blot 结果显示，两组外泌体均表达经典标志物 Alix、HSP90、CD63、TSG101 和 CD81，且 AMI 组的多数标志物表达水平明显高于健康对照组，与 NTA 检测的颗粒数量差异一致（图 2D）。

透射电子显微镜（TEM）观察显示，两组外泌体均呈现典型的杯状形态，无明显形态学差异（图 2E-F），综合 NTA、Western blot 和 TEM 结果可证实通过 EXODUS 系统成功分离并获得了高质量的尿液外泌体。

图2. 急性心肌梗死患者与健康对照者尿液外泌体的表征

03-尿液外泌体蛋白质组学特征

AMI 组与健康对照组的蛋白质色谱峰模式存在显著差异，AMI 组色谱峰呈现低丰度、密集分布特征，健康对照组则峰形尖锐清晰（图 3A）。

鉴定的蛋白质分子量主要集中在 20-200 kDa（图 3B）。共鉴定出 3194 种蛋白质，其中 3022 种为两组共有蛋白，AMI 组特有 36 种蛋白，健康对照组特有 102 种蛋白（图 3C）。

亚细胞定位分析显示，鉴定出的蛋白质主要来源于细胞质、分泌型蛋白和细胞核（图 3D）。GO 富集分析显示，共有蛋白在分子功能上富集于钙粘蛋白结合、磷脂结合，细胞组分上富集于细胞-基质连接、黏着斑，生物学过程上富集于中性粒细胞活化、脱颗粒等免疫相关通路（图 3E）；KEGG 富集分析显示，蛋白主要参与肌动蛋白细胞骨架调控和内吞作用通路（图 3F）。

与外泌体数据库 Vesiclepedia 对比，本研究鉴定的外泌体蛋白覆盖率超过 90%，进一步证实了外泌体分离的高纯度。

图3. 急性心肌梗死患者与健康对照者样本的蛋白质谱特征

差异蛋白筛选结果显示，共鉴定出 30 种差异蛋白，其中 17 种在 AMI 组上调，13 种下调，火山图和热图清晰展示了这些差异蛋白的表达特征（图 4A-B）。

亚细胞定位分析显示，差异蛋白主要来源于分泌型蛋白、细胞质和质膜（图 4C）。GO 富集分析显示，差异蛋白在细胞组分上富集于细胞外区域，分子功能上富集于钙离子结合，生物学过程上富集于细胞分化（图 4D）；KEGG 富集分析显示，补体和凝血级联通路为显著富集的通路，这与 AMI 后血管损伤、凝血激活的病理过程高度一致（图 4E）。

通过 STRING 数据库构建的蛋白质相互作用（PPI）网络，揭示了差异蛋白间的潜在功能关联，为后续核心标志物的筛选提供了依据（图 4F）。

图4. 急性心肌梗死患者与健康对照者的差异蛋白分析

04-疾病关联与候选生物标志物

对 30 种差异蛋白对应的编码基因进行疾病关联分析，结果显示心血管相关疾病在 AMI 中显著富集，证实这些差异蛋白与 AMI 存在密切的病理关联性（图 5A）。

通过对比 AMI 组与健康对照组的蛋白表达水平，筛选出 4 种核心候选标志物，其中 F2（凝血酶原）和 OLR1（凝集素样氧化低密度脂蛋白受体 1）在 AMI 组高表达，F3（组织因子）和 APCS（血清淀粉样 P 成分）在 AMI 组表达异常下调，这 4 种蛋白均能有效区分 AMI 患者与健康对照者，具备作为 AMI 生物标志物的潜力（图 5B）。

图5. 差异蛋白的疾病富集分析及潜在标志物表达对比

研究结论

本研究首次通过 EXODUS 系统成功分离并表征了 AMI 患者尿液外泌体，证实其在颗粒数量、标志性蛋白表达及蛋白质组学特征上与健康对照者存在显著差异，且这些差异可能反映了 AMI 的病理生理机制。

筛选出的 30 种差异蛋白中，F2、F3、OLR1 和 APCS 构成的蛋白质组合具有作为 AMI 无创生物标志物的潜力，其中 F2 和 OLR1 上调、F3 和 APCS 表达异常，与 AMI 的凝血激活、血管损伤等病理过程密切相关。

尿液外泌体作为无创、易获取的生物样本，其蛋白质组学分析为 AMI 的早期诊断提供了新的技术路径，有望弥补传统血清标志物的局限性，为临床转化提供了重要的生物学依据。

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