英文标题：Spatial mapping of metabolite distribution in Dendrobium officinale stems across different ages by MALDI-MSI

发表期刊：Food Research International

影响因子：8.0

客户单位：安徽农业大学

合作产品：植物NGM 2

研究背景

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura & Migo)是一种药食同源植物，其营养与药用价值日益受到关注。多糖、生物碱和黄酮为其主要活性组分，与药效密切相关。全面了解这些代谢物的时空分布规律，对确定最佳采收时间并解析其生物合成机制至关重要。然而，目前对铁皮石斛不同年生茎中代谢物空间分布的研究还很有限。本研究利用基质辅助激光解吸/电离质谱成像(MALDI-MSI)技术，分析了不同生长年限铁皮石斛茎样品(包括茎表皮和维管束)中生物碱、糖和黄酮类成分的含量变化和空间分布特征，并对其进行了可视化。同时，对代谢物在茎中的时空动态进行成像，筛选出积累特征明显的化合物，为确定铁皮石斛的最佳采收期提供依据。此外，本研究还对差异代谢物进行了富集分析，为后续深入探讨其生物合成机制开辟了新路径。

研究概览

图1 技术流程图

研究结果

1、番红-固绿染色

铁皮石斛茎横切面由外至内进依次为表皮、薄壁组织及维管束（图2A-C）。染色结果显示，不同生长年限的茎在维管束数量和形态上存在差异（图2D-F）。统计分析表明，维管束数量随茎龄增加而显著增多（图2G），维管束鞘厚壁细胞壁厚度亦随年限显著增厚，尤以二年生茎(DO-2)增厚最为显著（图2H）。二年生茎处于生长旺盛期，维管束密度升高可保障水分和养分运输；厚壁细胞为木质化厚壁组织，富含木质素和纤维素，赋予细胞壁高强度，既提供机械支撑又增强抗外界压力能力，使植株保持直立。

图2 石斛茎番红-固绿染色的横切切片及统计

2、总生物碱、多糖和黄酮类成分含量

对三年生铁皮石斛茎的生理指标的测定结果表明，活性物质累积量更高。茎的总生物碱含量介于0.0396%–0.0512%，不同年份间差异不显著（图3A）；总多糖含量从一年生25.854%升至二年生30.917%，三年生略降至30%左右，一年生最低，二、三年生无显著差异（图3B）；总黄酮含量随生长年限明显增加，范围0.17%–0.53%，三年生含量最高（图3C）。

图3 不同生长年限中总生物碱、总多糖、总黄酮含量的变化

3、PAS多糖染色

不同年限铁皮石斛茎段的PAS多糖染色结果显示，多糖主要储存在基质组织薄壁细胞中，呈颗粒状分布（图4）。一年生茎中颗粒数量少且分散（图4A），二年生略有增加（图4B），三年生颗粒数量最多并呈聚集状态（图4C）。这些结果表明，茎中多糖分布会随植株年龄增长而增加。

图3 三年生铁皮石斛茎中多糖的PAS染色切片

4、铁皮石斛茎中代谢物的鉴定

利用MALDI-MSI技术对三年生铁皮石斛茎的横切与纵切样品进行质谱成像分析。聚类热图显示，糖类、生物碱和黄酮含量随植株年龄增长而升高（图5B），一年生(Do-1)显著低于二、三年生(Do-2、Do-3)，初步验证了数据的可靠性。层次聚类将Do-2与Do-3归为同一组，提示三年生为代谢谱趋于稳定的阈值（图5C），不同年限茎段的平均质谱图如图6所示。

图5 铁皮石斛茎代谢物的鉴定与分析

图6 石斛不同年限茎段的平均质谱图

5、基于差异代谢物的KEGG富集分析

本研究共鉴定出Do-1 VS Do-2的500种DAMs和Do-1 VS Do-3的571种DAMs。KEGG通路分析显示，这些DAMs主要富集在“代谢通路”和“次级代谢物生物合成”，提示铁皮石斛的代谢合成随年龄而变（图7A-B）。两组比较共发现313个共有DAMs，其中包括铁皮石斛特有的生物活性化合物，如生物碱、糖、黄酮类化合物（图7C）。共有DAMs的富集分析则富集于吡啶生物合成、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、类黄酮生物合成等关键通路，为铁皮石斛活性成分的积累提供代谢依据。

图7 差异代谢物的KEGG富集分析

6、铁皮石斛茎中新亚麻苦苷、海藻糖、纤维二糖和山柰酚的MALDI分析与LC-MS/MS分析

新亚麻苦苷可保护植株免受食草动物和病原侵害。MALDI-MSI显示，该生物碱主要分布于铁皮石斛茎的维管束，并随年份增加而递增（图8A）。糖类是植物生长的重要能量来源，海藻糖和纤维二糖在茎内均匀分布，无明显区域差异；含量测定表明多糖在一年生最低、二年生最高、三年生略降，与质谱成像结果一致（图3B）。黄酮类化合物帮助植物适应逆境，山柰酚具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、神经保护及免疫调节活性。其空间分布随年限增加而上升：二年生茎表皮附近富集，其余区域均匀；三年生表皮信号减弱，其余区域仍均匀。对四种代谢物的相对丰度统计表明，新亚麻苦苷和海藻糖逐年递增，海藻糖和纤维二糖在二年生茎最高，三年生略降（图8B）。

利用LC-MS/MS对不同生长年限铁皮石斛茎中的四种代谢物进行定量分析（图8C）。结果显示，海藻糖和纤维二糖含量随年限递增；新亚麻苦苷与山柰酚含量则呈相反趋势，一年生最低、二年生最高，三年生略有下降但差异不显著。该结果与MALDI-MSI结果基本一致。

图8 MALDI-MSI分析及LC-MS/MS分析

7、铁皮石斛茎中新亚麻苦苷、海藻糖、纤维二糖和山柰酚的空间分割分析

基于MSI数据，对石斛茎中代谢物进行空间切割分析。结合冰冻切片和组织化学染色切片的结果，选择感兴趣的两个区域(表皮和维管束)进行进一步分析。石斛茎中海藻糖和纤维二糖的分布相对均匀，这两种化合物在表皮和维管束中均有分布，并且随着石斛生长年限的增加，其含量也相应增加（图9A-B）。海藻糖和纤维二糖的含量变化一致。

图9 石斛茎中海藻糖和纤维二糖的含量分析

8、代谢物的共定位分析

植物代谢物共定位分析采用Pearson相关系数和Manders共定位系数，以便于定量分析和探索代谢物之间的联系，并研究不同代谢产物在不同生长阶段的空间分布是否共存或重叠。结果如图10所示，在铁皮石斛的不同生长阶段，海藻糖和D-半乳糖，Galbeta1，3GlcNAc表现出明显的共定位，它们的空间分布和含量变化高度相似。纤维二糖和D-半乳糖表现出很强的相关性，这表明它们在代谢物的合成、运输和其他代谢功能方面存在密切的关系。

图10 代谢物空间分布共定位分析

9、铁皮石斛茎中其他代谢物的空间可视化及分布

石斛茎中的其他代谢物的分析如图11所示。D-半乳糖和Galbeta1，3GlcNAc在石斛茎中的含量随着生长年份的增加而增加。乌头碱和麦角碱在石斛茎中的分布规律较为一致。新香豆苷和peonidin 3-(6″-p-coumarylglucoside主要集中在石斛的维管部分，且随年限呈增加趋势。淫羊藿苷在石斛的一年生和二年生茎中被发现，且在二年生茎中的含量最高，而在三年生茎中的含量最低。

图11 铁皮石斛茎部组织切片中检出化合物的可视化分布分析

研究小结

本研究采用MALDI-MSI进行了空间成像和定量分析，共鉴定出1039种代谢物，其中碳水化合物、类固醇和类黄酮含量随时间增加而递增。这些趋势与生理测定结果高度一致，进一步证实了MALDI-MSI结果数据的可靠性。此外，通过与LC-MS/MS的交叉验证，增强了方法学的稳健性。这些发现为确定铁皮石斛茎的最佳采收期提供了关键的见解，从而提高了其食用和药用价值。

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