英文标题：Integrated landscape of plasma metabolism and proteome of patients with post-traumatic deep vein thrombosis

中文标题：创伤后深静脉血栓患者血浆代谢和蛋白质组学的系统分析

发表期刊：nature communications

影响因子：15.7

客户单位：西安交通大学

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

深静脉血栓形成(Deep Vein Thrombosis, DVT)是一种主要的健康问题，可导致各种并发症，如血栓后综合征、复发性DVT和危及生命的肺栓塞(Pulmonary Embolism, PE)。先前的研究已经确定了DVT的多种危险因素，如高龄、不活动、手术和住院。特别是，创伤个体继发于损伤模式和不活动的DVT风险增加。创伤后DVT(post-traumatic DVT, pt-DVT)长期以来被认为是成人人群中最相关的临床问题之一，它也是创伤后发病率和死亡率的主要原因。目前，pt-DVT的诊断依赖于d-二聚体的实验室测量和超声的特定成像特征(Ultrasound, US)，但d-二聚体在手术后或创伤性事件后的DVT风险患者中的应用尚不清楚。此外，手术可能造成继发性创伤，创伤患者血栓形成的预防和早期诊断在住院和围手术期护理中具有挑战性。因此，识别pt-DVT的生物标志物对于早期诊断和提供适当的DVT治疗是必要和重要的。

为了研究pt-DVT的潜在代谢机制，并在创伤性骨折患者中识别DVT患者，研究者使用非靶标代谢组学和蛋白组学研究pt-DVT患者和对照组之间的血浆代谢和蛋白的变化，并筛选与pt-DVT相关的生物标志物。

研究结果

2.1 研究队列的临床特征

研究设计和分析工作流程如图1所示。根据严格的纳入/排除标准，共有680名患者被纳入发现(N=580)队列和验证(N=100)队列。在发现队列中，从2018年10月至2020年12月招募了252名诊断为偶发性pt-DVT的患者作为病例，328名未诊断为DVT的患者作为对照。随后，从2021年3月至2021年7月，选择了50名pt-DVT患者和50名对照组，采用相同的招募标准作为单独的验证队列。pt-DVT组和对照组的基本特征大致平衡。

图1.实验设计与分析流程

2.2 pt-DVT患者的血浆代谢组特征

经过MS/MS鉴定和数据过滤，在所有批次中可重复检测到的326种代谢物被认为是稳定的，并保留用于后续分析。通过正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA)对两组间的代谢物进行分析，鉴定出96种对差异有显著贡献的代谢物（图2d）。通过单变量和多变量分析，共有28种代谢物是显著变化的，并绘制了28种代谢物的聚类热图（图2e）。

去偏稀疏偏相关(Debiased Sparse Partial Correlation, DSPC)网络（图3a）显示了偏相关系数显著的关系。该网络的拓扑结构表明，不同分类间和同一分类中代谢物之间存在密集的相互作用，其中脂质和氨基酸代谢之间的相互作用最为密集。此外，功能未知的代谢物主要占据了N2,N2-二甲基鸟苷和丙酮酸这两个代谢物附近的位置，这表明它们可能参与了脂质、氨基酸、核苷酸和碳水化合物的代谢。这些发现共同表明，一个高度协调的代谢物调控网络是血栓形成的基础。

图2.pt-DVT患者和对照组的代谢谱

图3.与pt-DVT相关的多种代谢途径失调

2.3 与pt-DVT相关的多种代谢途径失调

通路分析中，研究者发现了17条涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢的显著失调通路（图3b），表明pt-DVT组存在大规模代谢失调。17条显著改变的通路差异丰度(Differential Abundance, DA)评分（图3c）显示6条参与氨基酸代谢的通路活性升高；与碳水化合物代谢相关的所有5条通路的活性均显著上调，包括已被充分研究的柠檬酸循环（TCA循环）和糖酵解/糖异生；而与脂质代谢相关的3条通路的活性均下调。此外，研究者还发现了一些在pt-DVT中研究较少的氨基酸代谢途径，如半胱氨酸和蛋氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等。

2.4 pt-DVT患者CP簇改变

研究者确定了14个显著改变的临床指标(Clinical Parameters, CPs)，其中5个在pt-DVT患者中增加，其他的减少(4a)。Pearson相关分析显示CPs显著增加或减少，并倾向于聚集在一起（图4b）。有趣的是，功能相似的临床特征被分组在一个簇中，如CP最高的簇，包括纤维蛋白原(Fibrinogen, Fbg)、血小板红细胞压积(Platelet Hematocrit, PCT)和血小板计数(Platelet Count, PLT)，而降低最多的簇包括红细胞计数(Red Blood Cell Count, RBC)、红细胞压积百分比(Hematocrit Percentage, HCT)和血红蛋白浓度(Hemoglobin Concentration, HGB)。在此基础上，研究者揭示了pt-DVT的两个典型临床特征，一个是PLT-PCT-Fbg增加（称为PLT簇），另一个是RBC-HCT-HGB减少（称为RBC簇）。

研究者进一步评估了这6种CPs在PLT簇和RBC簇中诊断pt-DVT的效果，结果显示，PLT和PCT对pt-DVT具有极好的特异性，可能是有临床应用前景的诊断标志物。

图4.pt-DVT及相关代谢失调的临床差异指标

5.代谢组变化与pt-DVT相关血液特征之间的关系

通过计算代谢物和CPs的Pearson相关性系数，发现18种代谢物与PLT簇相关，17种代谢物与RBC簇相关，表明同一簇内的CPs具有相似的代谢模式。接下来，研究者使用线性回归模型，发现16种代谢物与PLT簇显著相关（图4c），15种代谢物与RBC簇相关（图4d）。研究者进一步使用与两者相关的代谢物进行了基于代谢途径的富集分析，如图4e所示，可能调控PLT簇改变的8条代谢途径主要涉及脂质代谢，尤其是脂肪酸的氧化。在这些途径中确定了4个关键代谢物，包括丙酰肉碱、左旋肉碱、5,6-DHET和5-羟色胺。

血浆中丙基肉碱、左旋肉碱和血清素水平升高与PLT、PCT和Fbg水平呈正相关。此外，有26条代谢途径与RBC簇相关（图4f），包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢途径等。除脂肪酸氧化和其他与脂质代谢相关的途径外，咪唑乙酸和丙酮酸水平的升高与血液中红细胞数量、HCT和HGB水平呈负相关。它可能通过碳水化合物和氨基酸代谢，如TCA循环和糖酵解/糖异生两种额外的能量代谢，参与pt-DVT的发病机制。

6.机器学习识别pt-DVT血液代谢物的生物标志物

为了验证预测模型的泛化能力，研究者对来自独立验证队列的100名参与者进行了代谢组学分析。如图5a-b所示，仅使用CPs预测pt-DVT的模型1的表现最差，表明目前仅使用CPs可能不足以诊断pt-DVT。相应地，模型2（仅代谢物）和模型3（CPs和代谢物）能够有很好地区分效果，这表明血浆代谢物在临床使用中对pt-DVT的早期诊断和预测有很大的贡献。特别是，包含9种代谢物（十六烷二酸、丙酮酸、L-Carnitine、5 -羟色胺、5,6-DHET、3-羟基癸酸、PE(P−18:1(11Z)/18:2(9Z,12Z))、3-甲氧基苯丙酸和戊腈）（图5c）的模型2在发现队列和验证队列中的表现都优于其他模型，表明具有更好的可预测性和泛化能力。

图5.机器学习识别pt-DVT特征代谢物

7.代谢组学和蛋白质组学分析揭示了pt-DVT的潜在治疗策略

考虑到蛋白质组学可以通过分析蛋白的代谢过程提供深刻的代谢视角，并有助于理解pt-DVT代谢，研究者对来自队列的96名pt-DVT患者和87名对照参与者进行了一项蛋白组学研究。总共定性定量了524个血浆蛋白，214个蛋白被鉴定为两组差异蛋白，其中pt-DVT患者中153个蛋白表达上调，61个蛋白表达下调（图6a）。差异蛋白富集的KEGG通路发现，pt-DVT患者中有15条通路发生显著改变（图6b）。值得注意的是，补体和凝血级联被认为是改变最显著的途径，这也是直接传递到DVT的调节途径。

结合代谢组学和蛋白质组学的结果，发现糖酵解/糖异生在代谢物和蛋白质水平上都发生了变化。糖酵解/糖异生产生丙酮酸用于TCA循环，而本研究发现，pt-DVT患者体内丙酮酸、柠檬酸和糖酵解/糖异生途径中的几种蛋白质均显著增加。因此，有理由推测，糖酵解/糖异生的上调可能导致血栓形成的发病机制。这促使研究者通过整合代谢组学和蛋白质组学数据，进一步探索糖酵解/葡萄糖生成的作用。

如图6c所示，发现丙酮酸上游的8个蛋白（LDHA、LDHB、GAPDH、GPI、PKM、MINPP1、ENO1和TPI1）在pt-DVT患者中显著上调。丙酮酸级联的糖酵解/糖异生-TCA循环是产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nictinamide Adenine Dinucleotide, NADH)的主要来源，在细胞氧化还原状态中起着至关重要的作用。已有研究表明，红细胞中的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)会改变红细胞膜结构，并在血栓形成时影响增强。与这些报道一致，本研究数据表明，ROS相关的过氧化物酶在pt-DVT中受到轻微干扰，PRDX5上调，PRDX2下调。此外，糖酵解/糖异生途径中变化最显著的蛋白乳酸脱氢酶(LDHA/LDHB)，参与多种细胞的活性氧生成。研究者推测，糖酵解/糖异生-TCA循环级联的上调可能与红细胞中ROS的积累有关，从而增强血栓形成。

总之，代谢组学和蛋白质组学数据强调了干预糖酵解/糖异生和氧化还原稳态可作为pt-DVT的潜在治疗靶点。

图6.代谢组学和蛋白质组学分析揭示了pt-DVT的潜在治疗策略

基于这些结果，研究者还对数据中与糖酵解/糖异生和氧化还原稳态相关的蛋白进行了药理学分析，并确定了50种靶向糖酵解/糖异生和氧化还原稳态的潜在化合物，从而促进了后续的功能研究和药物开发。

研究结论

本队列研究确定了28种代谢物和14种CPs与pt-DVT显著相关，并全面证明了pt-DVT患者血液中代谢和CPs的改变。基于这些显著改变的代谢物和CPs，研究者开发了一个由9种代谢物组成的组合，以有效区分pt-DVT患者。更重要的是，结合蛋白质组学数据，发现丙酮酸级联的糖酵解/糖异生-TCA循环的上调可能促进血栓形成，调节红细胞中的ROS水平。这表明干扰糖酵解/糖异生和氧化还原稳态可能是pt-DVT治疗的潜在治疗策略。

总的来说，本研究表征了pt-DVT的代谢失调，并通过大规模队列确定了血浆生物标志物。本研究的发现可以促进pt-DVT的功能研究，并有助于临床应用的早期诊断。

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