英文标题：Life cycle exposure to differentially charged polystyrene nanoplastics leads to gender-specific particle accumulation and neurotoxicity in zebrafish (Danio rerio)

中文标题：不同电荷聚苯乙烯纳米塑料的全生命周期暴露导致斑马鱼(Danio rerio)出现性别特异性颗粒积累与神经毒性

发表期刊：Environment International

影响因子：9.7

客户单位：中国环境科学研究院

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro、AQ700

研究背景

纳米塑料(Nanoplastics, NPs)广泛存在于淡水环境中，其光降解和物理、化学分解会导致塑料表面带不同的电荷。目前，许多研究侧重于评估生物体暴露于高浓度NPs后的毒性。在水生环境中，pH、离子强度和有机天然物质等特性会显著影响NPs的聚集。尽管许多研究已经调查了NPs的神经毒理学，但仍然存在大量的研究空白，包括不同电荷的NPs对神经结构和功能的影响。虽然有研究表明不同电荷是影响NPs在生物体内积累和神经毒性的关键因素，但其在体内的潜在影响仍知之甚少。

本研究将斑马鱼(Danio rerio)暴露于与环境浓度类似的10 μg/L的不同电荷聚苯乙烯(Polystyrene, PS)纳米塑料，其中PS不带电荷，PS-NH₂带正电荷，PS-COOH带负电荷。斑马鱼暴露培养120天后，研究人员通过光片显微镜三维成像、组织病理学、基因表达以及脑组织非靶标和靶标代谢组学检测，研究不同电荷NPs对神经毒性、脑损伤和脑代谢的潜在影响。

研究结果

2.1 不同电荷PS诱导斑马鱼脑损伤

本部分实验共设置4个处理组，分别为对照组（CK，即未暴露纳米塑料的ISO标准水环境）、未带电聚苯乙烯纳米塑料组（PS，暴露浓度10 μg/L）、氨基功能化聚苯乙烯纳米塑料组（PS-NH₂，带正电，暴露浓度10 μg/L）、羧基功能化聚苯乙烯纳米塑料组（PS-COOH，带负电，暴露浓度10 μg/L），每组样本量统一为6尾(n=6)。

将斑马鱼于暴露10 μg/L不同电荷PS培养120天后，研究人员发现斑马鱼脑发育的潜力受到抑制。与对照组相比，暴露于不同电荷PS对斑马鱼的体重、脑-体指数、脑损伤都有显著影响（图1）。

图1 斑马鱼生长情况及脑组织H&E染色的组织学变化

同时，研究人员分析了暴露于不同电荷PS对脑超微结构的潜在影响，发现暴露于不同电荷PS后，细胞核超微结构、血脑屏障结构、线粒体结构等均出现损伤（图2）。

图2 暴露于不同电荷PS后，雄性和雌性斑马鱼大脑超微结构变化的代表性透射电子显微镜图像

根据认知行为、抑郁样行为、社会行为实验结果，暴露于不同电荷的NPs对雌雄斑马鱼的神经毒性和认知、社交和情感行为也有显著的影响（图3）。

图3 斑马鱼暴露于CK、PS、PS-NH2、PS-COOH后的神经行为

基于三维荧光显微镜成像，研究人员确定了不同电荷PS在雄性和雌性斑马鱼脑区的荧光分布（图4A-B），并绘制了相关结构示意图（图4C）。对3D影像的统计分析显示，雄性和雌性斑马鱼大脑网状结构(Reticular Formation, RF)、下丘脑腹侧(ventral hypothalamus, Hv)的荧光强度(Fluorescence Intensity, FI)都发生了显著变化（图4D-E）。雄性斑马鱼大脑中，PS-NH₂和PS-COOH聚集在RF结构，而雌性斑马鱼大脑中，仅PS-NH₂在RF结构和Hv中检测到。这些结果表明，PS-NH₂在斑马鱼大脑的RF和Hv中积累，并导致记忆和抑郁样行为的异常表现。

10 μg/L PS或10 μg/L PS-COOH处理的雌性斑马鱼，其埃文斯蓝染料(Evans Blue Dye, EBD)外渗明显高于对照组，表明血脑屏障通透性明显增加，结构和完整性均受到干扰（图4F-G）。然而，不同电荷的PS似乎并没有直接干扰雄性斑马鱼血脑屏障的完整性。

图4 与对照组相比，不同电荷PS处理组的脑部三维荧光成像及血脑屏障通透性

雄性和雌性斑马鱼脑组织中神经炎症因子和神经形成的相关基因的相对表达水平如图5所示。与对照组相比，暴露于不同电荷PS对编码生长相关蛋白(GAP)、肿瘤坏死因子(TNFa)和白细胞介素-13(IL-13)等基因表达水平有显著影响。其中Mafbb的异常表达可能导致大脑出现明显的炎症反应。

图5 不同电荷PS暴露后雄性(A)和雌性(B)斑马鱼脑中神经炎症因子和神经发生相关基因的表达水平

2.2 斑马鱼大脑的非靶标代谢组结果

考虑到线粒体功能的重要性，研究人员通过非靶标代谢组学和靶标代谢组学确定可能受到影响的代谢途径，确定不同电荷PS对全身代谢稳态的毒性机制，并进一步了解对线粒体的结构影响。

非靶标代谢组结果显示，雄性斑马鱼大脑中，与对照或PS相比，暴露于不同电荷PS的代谢物发生显著变化（图6A-E）。

图6 雄性斑马鱼大脑非靶标代谢组学分析

为了进一步了解这些代谢物的变化，对雄性斑马鱼大脑的差异代谢物进行了代谢通路分析（图7）。与对照组相比，暴露于PS、PS-NH₂、PS-COOH后，在精氨酸和脯氨酸代谢途径以及丙氨酸代谢等方面存在明显差异。维恩图展示了暴露于不同电荷的PS后代谢途径的差异（图7F）。与PS相比，PS-NH₂、PS-COOH暴露组表现出不同的代谢途径。例如，PS-NH₂暴露影响泛酸和辅酶A的生物合成、谷胱甘肽代谢和嘧啶代谢，而PS-COOH则影响硫胺素代谢途径（图7D-E)。

图7 雄性斑马鱼大脑非靶标代谢组学通路分析

对雌性斑马鱼脑组织进行了相同的非靶标代谢组学分析，呈现出与雄性斑马鱼相似的代谢物变化模式（图8）。此外，对雌性斑马鱼大脑的代谢通路也进行了分析，以确定暴露于不同电荷PS影响的关键通路（图9A-E）。与对照组相比，氨基酰基-tNRA生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等通路有显著变化（图9A-C）。与PS组相比，PS-NH₂暴露对D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代谢、硫胺素、花生四烯酸等关键代谢通路产生了独特的影响（图9D）。PS-COOH诱导了与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢相关的通路，组氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等通路发生了显著变化（图9E）。

这些发现表明，不同电荷NPs暴露扰乱了线粒体中许多重要的生物过程，导致认知、情感和社交行为受到显著影响。

图8 雌性斑马鱼大脑非靶标代谢组学分析

图9 雌性斑马鱼大脑非靶标代谢组学通路分析

3 斑马鱼大脑的靶标代谢组结果

研究人员对斑马鱼大脑中的510种代谢物进行了靶标代谢组学研究。暴露于PS、PS-NH₂、PS-COOH的雄性斑马鱼大脑分析显示，只有一种代谢物减少：酪氨酸。与PS相比，PS-NH₂和PS-COOH均导致羟基脯氨酸水平降低(图10)。

图10 靶标代谢组学分析的雄性斑马鱼差异代谢物火山图

对于雌性斑马鱼，暴露于PS、PS-NH₂、PS-COOH后，与对照组相比，艾托因和酪胺代谢产物水平显著降低。此外，与PS相比，PS-NH₂和PS-COOH暴露导致3-甲基硫丙酸水平显著降低，肌酸水平显著升高（图11）。

靶标代谢组学结果表明，暴露在不同电荷PS环境下，斑马鱼大脑表现出许多失调的途径，其中一些与氨基酸有很强的联系。此外，斑马鱼大脑在暴露于不同电荷的PS后，与对照组相比存在性别特异性差异，还显示与PS相比存在电荷特异性差异。

图11 靶标代谢组学分析的雌性斑马鱼差异代谢物火山图

研究结论

总的来说，将斑马鱼暴露于与环境浓度类似的PS条件下培养120天后，研究人员观察到不同电荷NPs具有电荷特异性和性别特异性反应的神经毒性。暴露于PS、PS-NH₂、PS-COOH诱导脑和线粒体损伤和炎症反应。暴露于PS-NH₂后，雌性斑马鱼大脑中出现了Mafbb、IL-4和IL-13的失调，RF区和Hv区NPs的积累明显。重要的是，通过非靶标代谢组学分析，这些效应与雄性和雌性斑马鱼的不同生物学途径有关。这项工作的发现增加了对脊椎动物如何在脑损伤和内源性代谢方面对不同电荷的NPs应激作出反应的理解，并直接为准确理解这些新出现的污染物对公众和环境健康的风险提供了信息。

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