中文标题：肠道菌群失调引起维生素B6代谢紊乱以非皮质醇依赖型方式导致慢性应激相关的异常行为

发表期刊：Gut Microbes

影响因子：12.2

客户单位：中南大学湘雅三医院

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2

慢性应激与心理疾病、神经退行性疾病和脑老化相关，是21世纪的重要健康问题。慢性应激激活下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal, HPA)轴和交感神经系统(Sympathetic Nervous System, SNS)，从而损害健康。然而通过靶向应激反应信号预防慢性应激相关脑疾病在临床上面临挑战。研究表明，应激可显著改变肠道微生物群组成，而益生元、益生菌或粪菌移植可缓解慢性应激诱导的器官功能障碍和炎症反应。然而，现有研究多基于无菌小鼠模型，缺乏临床转化价值，且未充分探讨肠道菌群失调与慢性应激相关脑疾病之间的因果关系和潜在机制，尤其是在非无菌条件下。因此，本研究旨在探讨慢性应激是否通过诱导肠道菌群失调导致啮齿动物脑部疾病，并寻找不依赖于HPA轴的预防机制。

1、粪便移植再现慢性应激诱导的异常行为，血液皮质酮水平和炎症因子水平升高，以及独特的肠道微生物表型

为了研究肠道生态失调在慢性应激相关脑部疾病中的作用，研究人员对SPF级大鼠进行了28天的慢性约束应激，并将应激7、14、21、28天大鼠的盲肠内容物依次移植到正常大鼠盲肠中，每周一次，共4周（图1a）。结果显示，接受移植的大鼠出现了类似慢性应激诱导的行为异常（如新物体识别受损、巴恩斯迷宫错误增加、强迫游泳不动时间延长），外周血皮质酮和炎症因子（IL-6、IL-1β、IL-18）水平升高（图1b-i），且前额皮质和海马中突触后密度蛋白95(psd95)和突触蛋白(syn)表达减少（图1j-n）。这表明肠道微生物群失调与慢性应激诱导的核心表型密切相关。进一步的16S rRNA基因测序分析发现，慢性应激大鼠的肠道微生物α多样性显著降低，而粪便微生物群移植(Fecal Microbiota Transplantation, FMT)可增加肠道菌群的α多样性（图2a-f）。在科水平上，Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Clostridiaceae、Corynebacteriaceae的相对丰度在对照组与应激组以及假手术组与FMT组之间存在显著差异（图2g-h）。在属水平上，20种OTU计数高于100的肠道微生物在正常对照组和应激大鼠之间存在显著差异，其中应激大鼠肠道前5种微生物的百分比明显低于正常对照组（图2i）。这些结果表明，应激诱导的肠道微生物群变化促进了慢性应激相关核心表型的发展，包括异常行为和外周炎症反应。

2、用益生菌培养有益的肠道微生物群，可以防止慢性应激大鼠出现异常行为并降低血液皮质酮和炎症细胞因子水平

为了验证肠道生态失调在慢性应激诱导的核心表型中的作用，研究人员通过益生菌补充来预防慢性应激期间的肠道生态失调。结果显示，益生菌补充在一定程度上纠正了慢性应激诱导的肠道生态失调，增加了乳杆菌科和乳杆菌的水平，并部分恢复了应激大鼠肠道前5种微生物的丰度（图3）。此外，益生菌补充显著改善了应激大鼠的行为异常，并降低了外周血皮质酮和IL-6水平（图4）。

3、慢性应激诱导的肠道生态失调会改变血浆代谢物，包括维生素B6代谢

上述实验建立了慢性应激个体肠道菌群失调与异常行为改变之间的因果关系。研究者采用非靶标代谢组学技术检测血浆代谢物，比较慢性应激组、对照组、应激盲肠内容物移植(FMT)组和假手术组大鼠的血浆代谢物差异，结果发现应激组与对照组之间存在217种差异代谢物，FMT组与假手术组之间有46种差异代谢物（图5a-e）；KEGG信号通路分析显示两组比较中均涉及9条代谢途径，包括维生素B6代谢和嘌呤代谢（图5f-g），共发现20种共享差异代谢物，其中维生素B6家族的4-吡哆酸和4-吡哆酸盐水平在慢性应激组和FMT组大鼠中显著下降，而益生菌补充可恢复其水平（图5h-m）；此外，慢性应激组和FMT组大鼠肠上皮细胞中维生素B6吸收相关酶ALP的表达降低，Spearman相关性分析表明肠道菌群多样性与血浆代谢物水平密切相关，尤其是维生素B6代谢相关代谢物（图5i），这些结果表明慢性应激诱导的肠道菌群失调通过影响维生素B6代谢进而导致血浆代谢物的变化。

4、应激期腹腔注射维生素B6可减轻慢性应激大鼠的体重下降、行为异常、外周炎症和神经炎症，但对外周皮质酮水平无影响

为了进一步研究维生素B6在慢性应激大鼠肠道生态失调诱导的核心表型中的关键作用，研究通过在慢性应激大鼠中腹腔注射维生素B6，发现其能限制体重减轻，改善异常行为（新物体识别和巴恩斯迷宫测试），降低血液IL-6水平，但不影响皮质酮水平和外周血白细胞计数（图6a-j）。此外，维生素B6补充抑制了神经炎症和神经发生损伤，逆转了应激诱导的海马和前额叶皮质中psd95和syn水平的降低，并降低了应激大鼠腹腔巨噬细胞中IL-6基因的表达（图6k-n）。这表明维生素B6缺乏是慢性应激诱导的核心表型的关键因素，而维生素B6补充可抑制慢性应激诱导的全身和神经炎症，而不影响外周皮质酮水平。

5、炎症作为皮质酮的下游效应在慢性应激诱导的异常行为的发病机制中起关键作用

如上所述，慢性应激啮齿动物表现出外周血皮质酮和炎症细胞因子水平升高。维生素B6补充可抑制应激大鼠炎症细胞因子（如IL-6）释放，但不影响皮质酮水平（图6f-g）。研究进一步评估了皮质酮与炎症细胞因子在慢性应激行为异常中的关系：在野生型小鼠中，慢性应激诱导异常行为（如新物体识别受损、巴恩斯迷宫错误增加）和炎症反应（外周血IL-6、IL-1β升高）（图7）；而在Caspase 11敲除或Caspase 1抑制剂(Ac-YVAD-cmk)预处理的小鼠中，慢性应激虽导致皮质酮水平升高（图7-8），但未引发异常行为或炎症因子增加（图7a-d、8a-c、e-m）。这表明应激诱导的炎症是皮质酮的下游效应，即皮质酮需通过激活Caspase 1/11炎症通路介导行为异常，而维生素B6的作用独立于HPA轴，靶向皮质酮下游的炎症环节（图7-8）。

本研究发现，将慢性应激大鼠的盲肠内容物移植到正常大鼠体内可复制慢性应激诱导的核心表型，包括行为异常、外周血皮质酮和炎症因子水平升高，以及独特的肠道微生物表型。益生菌补充可有效抑制这些表型的发展。慢性应激诱导的肠道微生物表型与20种差异代谢物水平相关，包括维生素B6代谢物4-吡哆酸和4-吡哆酸盐。维生素B6补充可减轻慢性应激大鼠的体重减轻、异常行为和炎症，但不影响皮质酮水平。敲除caspase 11或抑制caspase 1可消除慢性应激诱导的异常行为，表明炎症是皮质酮的下游效应，在慢性应激相关脑疾病中起关键作用。研究还发现，慢性应激诱导的肠道生态失调扰乱了维生素B6代谢，导致炎症和脑疾病的发展。益生菌和维生素B6补充可纠正这些病理变化，具有潜在的临床应用价值。然而，研究存在局限性，如未评估腹腔注射与口服补充维生素B6的效果差异，且未明确特定细菌菌株与维生素B6代谢的关系。未来需要进一步研究慢性应激下肠道生态失调与维生素B6代谢紊乱之间的因果关系，并验证益生菌和维生素B6补充的临床疗效。