英文标题：L-Carnitine Regulates Regeneration of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
发表期刊：Blood
影响因子：23.1
研究背景
造血干细胞(HSCs)具有自我更新和多向分化能力，是干细胞移植治疗的基础。细胞代谢对HSCs自我更新和命运决定起关键调控作用，但由于人HSCs极度稀少且常规方法技术受限，人造血干/祖细胞(HSPCs)的直接代谢分析一直是该领域的瓶颈。
近日，中国医学科学院血液病医院程辉/程涛/江尔逊教授团队与清华大学药学院胡泽平教授团队合作，在期刊Blood上发表了题为"L-Carnitine Regulates Regeneration of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells"的研究论文。该研究利用优化的低输入质谱代谢组学平台，仅需约10,000个细胞即可完成代谢谱分析，系统绘制了18例健康成人骨髓中13种免疫表型定义的造血细胞类型的代谢图谱。研究发现L-肉碱驱动的脂肪酸氧化(FAO)是HSPCs的核心代谢特征，L-肉碱通过激活PPARA–TFEB信号轴促进线粒体代谢和自噬，维持干细胞再生能力。功能验证证实L-肉碱补充可改善健康供者及再生障碍性贫血(AA)患者HSPCs的体内外功能，揭示了具有临床转化潜力的可靶向代谢通路。
技术路线
研究结果
01.通过低输入代谢组学建立人骨髓造血的代谢谱
人HSCs的直接代谢分析因细胞极度稀少和常规方法技术受限而长期受阻。为系统绘制人造血层级的代谢架构，研究人员优化了低输入质谱代谢组学平台，从18名健康成人供者新鲜骨髓中分选13种免疫表型定义的造血亚群，每个样本仅需约10,000个细胞即完成代谢谱分析（图1A）。结果显示，在检测到的82种代谢物中，PCA将细胞类型沿淋巴系、髓系和红系三条分化轨迹分离（图1B）。HSPCs表现出保守的代谢谱：HSCs/MPPs中线粒体代谢相关代谢物升高；髓系MYE/NEU富集氧化还原和核苷酸代谢物；红系以IMP和肌酸为特征（图1C）。Mfuzz分析沿分化轨迹追踪代谢物动态，发现HSCs中高水平cGMP可能与NO信号归巢能力相关，NAAG和NAA可能作为谷氨酸/天冬氨酸储库支持再生。关键发现是，HSC/MPPs与分化群体比较显示最显著的差异来自脂肪酸相关代谢物：乙酰肉碱显著升高，而游离L-肉碱及多种脂肪酰基肉碱降低（图1D），这种相反趋势提示肉碱依赖性FAO通路的活跃通量，为后续机制研究奠定基础。
图1.通过低输入代谢组学建立人骨髓HSPCs的代谢谱
02.L-肉碱驱动的脂肪酸氧化是人HSPCs的代谢特征
受分化过程中酰基肉碱动态变化的启发，研究人员系统验证了FAO在造血层级中的分布。L-肉碱作为必需载体将长链脂肪酸以酰基肉碱形式导入线粒体进行β-氧化，产物乙酰-CoA转化为乙酰肉碱（图2A）。跨群体定量分析显示，乙酰肉碱在HSPCs中显著升高（图2B），游离肉碱和短/中链酰基肉碱降低（图2C–E），而分化细胞中积累长链酰基肉碱（图2F–I），提示终末分化时β-氧化减弱。沿特定分化轨迹的配对比较证实这一模式具有普遍性：淋巴系中乙酰肉碱在HSCs/MPP→MLP→B-NK保持高水平，向成熟B/T细胞逐渐恢复肉碱池；髓系中祖细胞阶段持续积累乙酰肉碱，晚期分化则恢复。为从多组学层面验证，研究人员分析了单细胞转录组数据集，GSEA和模块评分均显示HSPCs中脂肪酸代谢显著上调（图2J–O）。qRT-PCR和免疫印迹确认FAO限速酶CPT1A/CPT2及转运体L-肉碱转运体(OCTN2)在HSPCs中高表达（图2P）。Seahorse结合CPT1A 特异性抑制剂(etomoxir)抑制实验直接证实HSPCs具有更高的FAO活性（图2Q–R）。代谢组学、转录组学和功能数据三重汇聚，确立L-肉碱驱动的FAO为人HSPCs的决定性代谢特征。
图2.脂肪酸氧化代谢在HSPCs中高度活跃
03.L-肉碱缺乏伴随FAO破坏损害HSPCs再生
为功能验证L-肉碱对HSPCs再生的必要性，研究人员采用shRNA敲低脐血CD34⁺ HSPCs中的OCTN2（图3A）。非靶标代谢组学显示三个独立shRNA共享16个差异代谢物，最一致的变化为脂肪酰基肉碱减少（图3B–C）；靶标代谢组学验证乙酰肉碱和总肉碱下降；Seahorse结合etomoxir证实FAO活性降低（图3D–E）。OCTN2 KD未影响凋亡，但导致细胞扩增减少，表现为BrdU⁺比例下降、G0/G1阻滞增加、S期进入减少及CDK6水平降低（图3F）。功能层面，OCTN2 KD显著降低CFU集落形成能力（图3G–H）。体内长期重建试验中，OCTN2 KD HSPCs移植入NOG小鼠后16周，外周血和骨髓中hCD45⁺、CD33⁺、CD19⁺和CD34⁺各区室均显著减少（图3I–M），脾脏谱系频率亦降低（图3N）。二次移植中，mCherry⁺ OCTN2 KD细胞在外周血几乎检测不到，骨髓和脾脏中显著减少（图3O–R），表明长期自我更新能力严重丧失。综上，OCTN2遗传抑制通过减少FAO损害人HSPCs体内外再生潜能。
图3.L-肉碱缺乏损害HSPCs体内外再生
04.L-肉碱缺乏破坏TFEB驱动的溶酶体自噬
为解析L-肉碱耗竭的下游分子事件，研究人员在OCTN2 KD HSPCs中进行RNA-seq和ATAC-seq。三个shRNA鉴定出527个重叠DEGs，KEGG富集显示溶酶体相关通路及AMPK、PI3K–Akt信号显著下调（图4A–B）；ATAC-seq揭示自噬和线粒体自噬位点染色质可及性降低（图4C），表明FAO损害导致溶酶体稳态破坏和自噬抑制。研究人员随后聚焦溶酶体/自噬主调节因子TFEB。qRT-PCR和免疫印迹显示OCTN2缺陷HSPCs中TFEB和PGC-1α显著下调，c-MYC无变化（图4D–E）。免疫荧光证实TFEB核定位减弱和LAMP1+溶酶体含量减少（图4F）；流式分析显示CD34⁺CD38⁻CD45RA⁻CD90⁺ HSCs中LysoTracker强度和MitoTracker强度均显著降低（图4G–J）。Seahorse代谢通量分析揭示OCR和ECAR均显著下降，证实全面线粒体功能障碍（图4K–N）。DNA损伤信号也相应增加。为验证TFEB的因果关系，研究人员在OCTN2 KD HSPCs中进行TFEB过表达挽救实验（图4O）。TFEB OE恢复了双阳性HSCs中溶酶体和线粒体功能（图4P–R），RNA-seq确认溶酶体/自噬通路转录上调，关键效应分子PRKN上调，线粒体生物发生标志PGC-1α表达恢复（图4Q）。这些结果确立TFEB位于L-肉碱依赖性FAO下游，OCTN2介导的L-肉碱摄取通过维持TFEB驱动的溶酶体自噬和线粒体生物发生保持HSPCs功能。
图4.L-肉碱缺乏抑制TFEB介导的自噬
05.PPARA介导L-肉碱驱动的FAO与TFEB活性
已知TFEB活性在L-肉碱缺乏下减弱，研究人员寻求鉴定连接肉碱驱动FAO与TFEB的上游调节因子。PPARA是FAO的经典转录调节因子，脂肪酰基肉碱已被鉴定为其内源性激活剂，且PPARA可在其他系统中诱导TFEB表达。利用公开人血液组织数据集分析，发现PPARA与TFEB表达呈强正相关（图5A）；OCTN2 KD显著降低PPARA蛋白水平（图5B）；单细胞数据显示PPARA优先表达于原始HSPCs（图5C–5D）。为直接验证PPARA对TFEB的调控，研究人员在CB CD34⁺ HSPCs中敲低PPARA，结果TFEB和PGC-1α在mRNA和蛋白水平均下调，OCTN2不受影响，CPT1A/CPT2也下调（图5E–5F）。功能上PPARA KD降低CFU集落形成（图5G–5H），Seahorse显示OCR和ECAR均显著降低（图5I–5L），完全表型模拟OCTN2 KD的效应。为检验PPARA能否在肉碱缺乏下挽救TFEB功能，研究人员在OCTN2 KD HSPCs中共表达PPARA（图5M）。PPARA OE在野生型和OCTN2 KD细胞中均上调TFEB表达（图5N），恢复CD34⁺CD38⁻CD45RA⁻CD90⁺HSCs中溶酶体和线粒体质量（图5O–P），逆转OCTN2 KD对集落形成的抑制（图5Q–R）。RNA-seq确认PPARA OE上调FAO、溶酶体-自噬和线粒体自噬通路（图5S–T）。机制上，CUT&Tag和荧光素酶报告实验证明PPARA直接结合TFEB启动子并激活转录（图5U–V）。最终，在PPARA KD HSPCs中过表达TFEB完全挽救了CFU计数（图5W–5X），确认PPARA通过TFEB激活调控HSPCs功能。这些结果确立PPARA为L-肉碱–FAO–TFEB轴的关键上游调节因子。
图5.PPARA是连接L-肉碱驱动FAO与TFEB介导自噬的中介因子
06.L-肉碱增强FAO和TFEB活性以维持HSPC再生
为直接评估外源性L-肉碱的治疗潜力，研究人员在体外向脐血CD34⁺ HSPCs补充L-肉碱（图6A）。L-肉碱处理显著上调PPARA、CPT1A、CPT2和TFEB转录（图6B–C），与OCTN2抑制剂米屈肼共处理后效应消除，证明依赖肉碱摄取（图6B）。免疫荧光显示L-肉碱增强TFEB表达和核转位（图6D）。非靶标代谢组学揭示全局代谢重塑：101个差异代谢物中88个上调，近半为脂肪酰基肉碱，通路富集显示FAO和肉碱转位机制显著激活（图6E）；靶标代谢组学验证乙酰肉碱和总肉碱升高。Seahorse检测显示L-肉碱增加FAO OCR、糖酵解和糖酵解能力（图6F–I），降低ROS水平和DNA损伤信号。RNA-seq和ATAC-seq证实脂肪酸代谢、自噬、溶酶体和糖酵解通路强力激活，线粒体自噬/自噬位点染色质可及性增加（图6J–K）。功能验证方面，L-肉碱显著增加CFU集落数，包括BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM（图6L）。体内NOG异种移植中，L-肉碱预处理HSPCs使外周血人CD45⁺、CD19⁺、CD33⁺细胞频率显著升高（图6M–O），16周时骨髓CD34⁺ HSPCs和成熟谱系频率增加（图6P–Q），脾脏嵌合率升高（图6R）。成人供者HSPCs甲基纤维素培养同样证实L-肉碱增强再生能力。L-肉碱补充通过增强FAO和TFEB活性改善人HSPCs代谢适应性和再生能力。
图6.L-肉碱通过增强PPARA-TFEB维持HSPCs再生
07.L-肉碱改善再生障碍性贫血中HSPCs功能
鉴于AA患者HSPCs中存在脂肪酸代谢和自噬异常，研究人员检验L-肉碱能否在疾病背景下恢复干细胞功能。对SAA患者与健康对照BM HSPCs的scRNA-seq重分析显示：SAA HSPCs中DNA复制和细胞周期通路下调，再生潜能丧失；FAO、吞噬和内吞通路代偿性上调；坏死性凋亡通路富集提示炎症/毒性应激驱动代谢重编程；但ATP合成、线粒体电子传递和氧化磷酸化通路下调（图7A–B），表明分解代谢信号增加无法补偿线粒体能量输出受损——即适应不良的代谢状态。为验证L-肉碱的治疗潜力，研究人员将AA患者BMNCs体外L-肉碱处理后分离CD34⁺ HSPCs行RNA-seq（图7C）。GSEA显示L-肉碱上调脂肪酸代谢、ATP合成和饥饿反应通路（图7D），与线粒体活性恢复一致。功能上，L-肉碱以剂量依赖方式增强再生：初级和次级甲基纤维素培养中总集落数和各谱系产出均增加（图7E–F）。移植试验进一步验证AA背景下HSPCs体内功能改善（图7G–J）。L-肉碱补充恢复AA HSPCs中ATP产生、改善细胞能量学并挽救再生潜能，提示其可作为骨髓衰竭综合征中改善干细胞功能的临床可操作佐剂。
图7.L-肉碱改善再生障碍性贫血中HSPCs的再生
研究总结
该研究的更广泛目标是识别可增强HSPCs功能的可操作代谢通路。研究结果表明，L-肉碱补充通过激活PPARA–TFEB轴促进HSPC再生能力，支持线粒体完整性、能量产生和自噬流。重要的是，这些效应不仅限于健康供者HSPCs，还延伸至再生障碍性贫血患者来源的细胞，其中L-肉碱介导的代谢重塑恢复了再生功能。总之，该研究为人类造血系统提供了全面的代谢框架，并鉴定了一个可靶向的L-肉碱–PPARA–TFEB通路来维持HSPCs功能。这些发现不仅拓展了我们对人干细胞代谢的理解，还为临床环境中增强造血再生开辟了新的转化途径。
