文章标题：Co-critical golden-flower fungus (Eurotium repens) contributed to characteristic flavor formation of two Yunnan jinhua teas through jinhua formation during the storage
发表期刊：Food Chemistry
影响因子：9.8
合作单位：南京农业大学
百趣提供服务：风味组学（VOCs 顶空）、PRM精准植物广靶、宏基因组测序
研究亮点
1. 鉴定匍匐散囊菌(Eurotium repens)为云南自然贮藏金花茶的共生关键优势金花菌，推翻 “仅冠突散囊菌为金花菌” 的传统认知，明确自然仓储金花与人工发花的菌种差异。
2. 采用宏基因组+风味组+代谢组多组学联用，阐明该菌通过糖苷水解、胡萝卜素降解、类黄酮转化，分别形成金花白茶 “金花菌香” 与金花熟普 “中药香”，并改善茶汤醇厚感的分子机制。
3. 针对云南金花熟普+金花白茶开展系统研究，明确仓储发花现象(JFDS)的独特规律，为云南仓储老茶品质调控、定向发花与风味改良提供科学支撑。
研究背景
仓储发花现象(JFDS)在两款云南茶中被发现，这两款茶分别被定义为金花熟普洱茶(JRIPT)和金花白茶(JWT)。本研究构建了宏基因组、挥发性代谢组与非挥发性代谢组整合的多组学技术体系，旨在解析金花形成过程的作用机制。匍匐散囊菌(Eurotium repens)是一种介导金花形成的金花菌，其在云南金花茶中的相对丰度均超过50%。基于检测到的291种挥发性有机化合物和83种气味活性物质分析，匍匐散囊菌可直接促进糖苷水解与类胡萝卜素降解，生成芳樟醇、β-紫罗兰酮和3，4-脱氢-β-紫罗兰酮，塑造金花白茶特有的金花菌香气；在Arxula adeninivorans协同作用下，匍匐散囊菌的代谢活性通过促进倍半萜类和甲氧基苯类物质积累，赋予金花熟普洱茶独特的药香特征。此外，金花形成过程中匍匐散囊菌的代谢活动还会加速儿茶素的氧化聚合，以及其他黄酮类物质的转化，进而提升茶叶的醇和口感。
研究结论
01.四种云南茶感官评价结果
初制工艺分别造就熟普洱茶(RIPT)、普通白茶(GWT)的独特风味：渥堆发酵让RIPT形成陈香与醇和口感，萎凋工艺则使GWT兼具花香、果香且带轻微青草气。长期贮藏能降低茶叶苦涩与鲜爽感、促进陈香形成，JFDS能进一步让RIPT与JRIPT、GWT与JWT形成显著风味差异，其中JWT的金花菌香、JRIPT的药香特征尤为突出。
JFDS显著提升JWT的花香、草本香和木质香强度，塑造典型金花菌香，还加速其苦涩感降低、青草气消退。相较之下，因JRIPT在JFDS中的微生物活性低于普通熟普洱茶渥堆发酵阶段，该过程对其滋味、汤色和叶底无显著影响。总体而言，原料因素（茶树品种、茶类、等级等）、金花菌菌种及工艺条件，均会影响金花菌香的形成。
02.匍匐散囊菌参与JRIPT和JWT的JFDS
2.1 真菌群落结构对比分析
测序获938383条有效ITS序列，聚类得到341个真菌分类操作单元(OTUs)（图1a），覆盖率超99.90%，适用于微生物组学分析。渥堆发酵使RIPT的OTUs数远低于GWT；且JFDS显著降低真菌群落的多样性指数以及基于Chao1指数的丰富度（图1b）。本研究中JFDS降低真菌群落多样性和丰富度的同时加速茶叶陈化，这与RIPT渥堆发酵、金花茶发花的真菌群落变化趋势一致。
研究表明，JFDS使JRIPT与RIPT、JWT与GWT的真菌群落结构产生显著差异（图1c-d）。渥堆发酵中微生物的强烈代谢消耗了游离氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白等大部分营养物质，增加了JRIPT的JFDS难度；其中JRIPT在JFDS中的PCA总方差贡献率约49.7%（图1c），而JWT与GWT因JFDS产生的PCA总方差贡献率达60.3%（图1d）。
图1. 四种云南茶叶间真菌群落结构的比较
2.2 与JFDS相关的特征真菌群落
本研究鉴定的OTUs归为4门、20纲、46科、113属、149种，与已有研究一致。热图分析可区分JRIPT与RIPT、JWT与GWT，表明JFDS在属水平彻底改变自然贮藏茶叶的真菌群落组成；Eurotium、Blastobotrys、Wallemia、Aspergillus为优势属，其相对丰度(relative abundance, RA)在四款茶中差异显著（图2a-b）。JRIPT和JWT中高丰度的Eurotium参与JFDS，与金花茶发花的属水平研究一致。受初制工艺影响，Blastobotrys为(J)RIPT第二优势菌属，Wallemia为JWT/GWT第二优势菌属；而JFDS分别降低了JRIPT中Blastobotrys、JWT中Wallemia的RA，表明其可彻底重构茶叶原有真菌群落结构。Aspergillus作为渥堆发酵核心功能菌群，在JRIPT中RA不足，说明JFDS与渥堆发酵的真菌群落演替趋势不同。Eurotium与Blastobotrys、Wallemia呈极显著强负相关，证实Eurotium在JFDS中对这两类优势菌属存在抑制作用。
2.3 参与JFDS的核心金花菌
研究发现，JFDS彻底改变自然贮藏茶叶的真菌群落结构与组成；所有茶样中检测到的14种核心真菌，在(J)RIPT中RA合计超95%，在云南白茶中合计超80%。其中Eurotium与Blastobotrys为(J)RIPT优势类群，Eurotium和Wallemia为云南白茶优势类群（图2c）。
匍匐散囊菌和嗜盐散囊菌为JFDS潜在功能菌群，二者的RA在云南金花茶与对照茶样间差异显著（图2d）；云南金花茶中匍匐散囊菌RA达51.5%~79.3%，嗜盐散囊菌RA则在0.1%~2.4%，因此匍匐散囊菌是JRIPT和JWT中参与JFDS的核心金花菌，这与金花茶传统发花的优势菌种存在物种水平差异。
图2. 云南四种茶叶中的共临界真菌群落，以及金花真菌对JFDS的作用
03.JFDS对细菌群落结构的影响
测序获899215条有效16S rRNA序列，聚类得1900个细菌OTUs（图3a）；渥堆发酵使(J)RIPT细菌群落多样性、丰富度低于云南白茶。JFDS对细菌群落影响较真菌有限，但仍显著降低其多样性与丰富度（图3b）。PCA、PCoA、NMDS均证实JRIPT与RIPT、JWT与GWT的细菌群落结构差异显著（图3c-d），表明JFDS对细菌结构产生了深远影响。
1900个细菌OTUs归为29个门、90个纲、172个目、301个科、620个属，云南白茶含27个门、468个属，(J)RIPT含21个门、356个属。对前30菌属热图分析显示JFDS改变了RIPT、GWT自然贮藏的细菌群落组成：JRIPT中芽孢杆菌属RA从5.39%升至34.5%，葡萄球菌属、克氏菌属等RA降低（图3e）；此外，JFDS使JWT中劳森氏菌属、泛菌属等RA提升，甲基杆菌-红甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属RA显著下降（图3f）。
图3. 四种云南茶叶间细菌群落结构的比较
04.四种云南茶叶的挥发性有机化合物谱图特征及差异
4.1 挥发性有机化合物分类
通过HS-SPME-GC–MS检测到291种高相似度挥发性有机化合物(VOCs)，归为12类，烃类含量最高，其次为含氧杂环类、萜烯类等（图4a）。受初制工艺（尤其是渥堆发酵）影响，(J)RIPT的VOCs种类和含量均低于云南白茶，如RIPT的VOCs总含量约为1670 μg/kg，不足GWT（3781 μg/kg）一半；渥堆发酵使醇类、酸类等含量降超70%，甲氧基苯类含量增加12倍，赋予RIPT陈香（图4a）。
4.2 VOCs的热图分析与(O)PLS-DA
热图分析与PLS-DA均能有效分类鉴别四款云南茶，说明JFDS对VOCs谱图的影响仅次于初制工艺（图4b）。与对照茶样相比，JFDS显著提升JRIPT和JWT的VOCs总含量；该过程使两款金花茶中萜类、含氧杂环类等化合物含量显著升高，萜烯类、醇类、醛类含量显著降低（图4c）。
OPLS-DA模型对RIPT与JRIPT、GWT与JWT的VOCs谱图鉴别效果良好（图4d）。结果表明，在核心真菌的协同作用下，匍匐散囊菌在贮藏期金花形成过程中的代谢活动产生了大量差异挥发性有机化合物，可作为JRIPT和JWT的特征鉴别指标。
4.3 与JFDS相关的差异VOCs
因渥堆发酵后微生物活性降低，在共检测的211种VOCs中，JRIPT的JFDS仅产生约20种差异VOCs（图4d）。并且匍匐散囊菌通过酯化反应生成酯类/内酯类化合物，经酚类O-甲基化促进甲氧基苯类积累。云南白茶为JFDS微生物代谢提供充足营养，使JWT中6种萜类、3种萜烯类、3种内酯类及2,2,6-三甲基环己酮显著上调，赋予JWT典型的金花菌香气（图4d）；同时6种酮类、5种醛类等显著下调，降低其青草气。综上，云南茶香气物质的分布特征及与JFDS相关的特征香气物质，仍需深入研究。
图4. 四种云南茶叶的VOCs分布特征及其JFDS效应
05.JFDS的特征香气物质及其与核心真菌的相关性
5.1 云南茶叶的香气物质分布
渥堆发酵显著减少香气物质种类、改变分布特征，使两类茶44种香气物质含量差异显著。5种甲氧基苯类、10种萜类、8种倍半萜类、11种醛类、6种含氧杂环类化合物共同参与RIPT香气形成（图5a），其生成源于微生物介导的糖苷水解、单/倍半萜生物合成、类胡萝卜素与酚酸降解及脂肪酸氧化反应。JFDS中，具草本香的α-扁柏烯、木质香的β-紫罗兰酮等倍半萜OAV提升，与三甲氧基苯等甲氧基苯类协同，赋予JRIPT独特药香。
相较于GWT，JFDS显著降低2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇的ACI值，减弱青草气，为JWT金花菌香形成创造条件（图5a）；同时提升2,2,6-三甲基环己酮、苯乙醇、芳樟醇氧化物、二氢猕猴桃内酯等含量，增强JWT果香。此外，JFDS中β-芳樟醇、藏红花醛、β-大马酮等具草本香、花香、木质香的萜类/萜烯类化合物OAV均上升，这类物质共同塑造了JWT的特征金花菌香。
5.2 JFDS的作用及金花菌香形成机制
本研究选取萜类、萜烯类、醛类为主的77种香气物质，探究JFDS对云南金花茶特征风味的影响。JFDS中匍匐散囊菌在微生物协同作用下，推动JWT金花菌香与JRIPT药香形成，其机制为：微生物介导芳樟醇糖苷水解提升β-芳樟醇含量；促进类胡萝卜素降解氧化生成紫罗兰酮、香叶基丙酮等；促使没食子酸脱羧与O-甲基化。此外，JFDS通过芳樟醇氧化物糖苷水解提升3种芳樟醇氧化物OAV，这类物质与二氢猕猴桃内酯、己酸乙酯等内酯类、酯类物质积累协同，显著增强JWT的果香。
5.3 核心真菌与特征香气物质形成的相关性
如图5b，匍匐散囊菌在云南金花茶特征风味形成中占主导，其与26种香气物质呈极显著正相关，促进了JWT的金花菌香。因匍匐散囊菌在JRIPT中相对丰度较低，其对该茶特征风味的直接参与受限；在RIPT中，与另一优势菌Arxula adeninivorans的协同下，该菌通过提升倍半萜类、甲氧基苯类物质含量，间接促使JRIPT在JFDS中形成药香。而优势菌Wallemia canadensis在JFDS中推动2-甲基丁醛等物质含量降低，减弱了JWT的青草气。
综上，匍匐散囊菌通过促进糖苷水解和类胡萝卜素降解推动JWT形成金花菌香，证实其在茶叶贮藏中的应用潜力；外源接种该菌，或可通过JFDS使云南白茶产生金花菌香、使RIPT产生药香特征。
图5. 四种云南茶叶中的气味物质分布(a)，以及JFDS中14种共关键真菌与52种特征性气味物质之间皮尔逊相关系数的热图(b)
06.JFDS中的黄酮类物质转化
本研究经UHPLC–QTrap–MS/MS鉴定出165种黄酮类物质，含11种黄烷醇、35种黄酮醇等7类（图6a）；其中黄烷醇类（儿茶素、原花青素）含量占主导，其次为黄酮醇、黄烷酮等。渥堆发酵已使(J)RIPT的黄烷醇、黄酮醇等含量偏低，而JFDS主要通过匍匐散囊菌的作用，显著影响JRIPT和JWT的黄酮类物质代谢：该菌推动没食子酰基化儿茶素水解为非没食子酰基化儿茶素和没食子酸，水解产物进一步氧化聚合、缩合，生成茶黄素等茶色素及多种原花青素（图6b），既降低JWT苦涩感，又提升JRIPT醇和口感。没食子酸还会经缩合、酯化转化为鞣花酸和没食子酸甲酯（图6b）；同时匍匐散囊菌加速槲皮素-O-糖苷、花青素等多种糖苷类黄酮水解为苷元，这类物质的增加或能增强茶叶保健功效，如延缓认知衰退。结合微生物发酵潜在代谢途径，匍匐散囊菌在JFDS中通过水解、羟基化、氢化、O-甲基化和糖基化反应，推动黄酮醇、黄烷酮、黄酮的代谢与相互转化（图6c）。
图6. 165种检出黄酮类化合物的分类与分布(a)、黄烷醇代谢过程(b)以及JFDS中黄酮醇、黄烷酮与黄酮的相互转化关系(c)
研究总结
本研究结合感官审评，构建宏基因组学、挥发性代谢组学与代谢组学整合的多组学体系，以JRIPT、JWT两款云南金花茶为对象，与RIPT、GWT对照，系统阐明JFDS对云南金花茶风味形成的调控作用。研究表明，JFDS显著降低微生物群落多样性，使JWT形成金花菌香、JRIPT形成药香；14种核心真菌中，JFDS关键金花菌匍匐散囊菌在两款金花茶中丰度较高，且彻底改变了茶叶自然贮藏的微生物群落结构。基于291种VOCs与83种气味活性物质分析，除渥堆发酵等初制工艺外，JFDS对茶叶VOCs谱图和香气物质分布也影响显著。本研究为利用匍匐散囊菌及其他金花菌，通过JFDS改良茶叶风味提供了理论依据。
