文章标题：The anti-NMDAR1 antibodies and IL-17 signaling pathway shape NMDAR encephalitis 

发表期刊：Molecular Psychiatry

影响因子：10.1

客户单位：南华大学附属第一医院

百趣提供服务：AQ700（现已升级为AQ1100高通量靶标定量）

研究背景

抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎(NMDARE)是一种严重的自身免疫性疾病，其核心特征是患者脑脊液(CSF)和血清中存在靶向NMDAR1的自身抗体。该病临床表现复杂多样，常见癫痫发作、认知衰退及行为异常等，患者恢复周期长且易出现远期后遗症与复发。

尽管抗NMDAR1抗体被证实可通过诱导细胞表面NMDAR1内化减少，导致NMDAR功能低下，进而参与疾病发生，但癫痫发作等部分临床症状无法仅通过这一机制解释。研究已发现，NMDARE患者CSF中与血脑屏障损伤及脑炎症相关的细胞因子、趋化因子水平显著升高，提示脑炎症等其他因素可能共同介导疾病表型。

当前对NMDARE分子机制的理解主要依赖体外二维细胞培养和动物模型，前者难以复刻人脑复杂的细胞间相互作用，后者则缺乏人类免疫反应特异性，均存在明显局限。近年来发展的人类前脑类器官(human forebrain organoids, hFOs)作为多能干细胞衍生的三维培养模型，能够模拟人类大脑的复杂细胞结构与生理功能，已成功应用于病毒性脑炎等疾病研究，为精准解析NMDARE发病机制、开发新型治疗策略提供了新的平台。

研究结论

01.NMDAR1-Ab暴露降低hFOs中细胞表面NMDAR1的强度

研究者使用hFOs研究了靶向NMDAR1亚基的自身抗体(anti-NMDAR1 antibodies, NMDAR1-Ab)暴露的功能效应。hFOs由一名健康供体来源的人诱导多能干细胞(hiPSCs)，根据已发表的方法诱导生成（图1a）。生成的hFOs具有前脑特征，包含类似脑室的结构、中间区和皮质样区域（图1b）。除了神经谱系细胞类型外，表达星形胶质细胞标记或寡突胶质细胞标记的细胞也存在于hFOs中（图1c），表明hFOs包含了发育中人脑中存在的主要细胞类型。重要的是，免疫染色证实了NMDAR1在hFOs中的广泛表达（图1c）。

先前的一项研究使用靶向NMDAR1 N端结构域的商业抗体和人NMDAR1-Ab来构建NMDARE模型。在此，根据先前研究中使用的抗NMDAR1 IgG浓度，将第110天的hFOs暴露于靶向NMDAR1 N端结构域的商业单克隆抗体或对照IgG 24小时。免疫染色分析显示，NMDAR1-Ab暴露不影响神经元的总密度，但导致hFOs中细胞表面NMDAR1几乎完全消失（图1d-e）。为了在NMDARE患者中验证这些发现，收集了6名诊断为NMDARE的患者和6名对照的CSF样本。基于细胞的检测证实了所有患者CSF样本中均存在抗NMDAR1 IgG抗体。然后从NMDARE患者或对照的混合CSF样本中纯化了IgG抗体。暴露于患者CSF来源的IgG抗体的hFOs也显示细胞表面NMDAR1几乎完全消失，但未改变hFOs中神经元的总密度（图1f-g）。

图1.NMDAR1-Ab暴露降低了hFOs中细胞表面NMDAR1的强度

02.NMDAR1-Ab暴露影响神经元突触传递及谷氨酸能通路相关基因表达

接下来进行了RNA-seq分析，NMDAR1-Ab暴露组和对照组hFOs之间的差异基因表达分析共鉴定出2958个差异表达基因(DEGs)。在这2958个DEGs中，1646个基因在NMDAR1-Ab暴露的hFOs中上调，1312个基因下调（图2a）。

使用WebGestalt对DEGs进行功能注释，发现1646个上调的DEGs，在前体代谢物和能量产生、核糖核蛋白复合物生物发生和RNA剪接等生物学功能中富集。KEGG通路分析显示，1646个上调的DEGs与亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病和氧化磷酸化在内的通路相关（图2b）。

对于1312个下调的DEGs，GO富集分析显示它们在轴突发育、跨突触信号调节、突触小泡循环和钙离子调节的胞吐作用中显著富集。KEGG通路分析显示，这1312个下调的DEGs与尼古丁成瘾、吗啡成瘾、轴突导向、GABA能突触和谷氨酸能突触等通路相关（图2c）。这些结果强调了NMDAR1-Ab暴露下调了富集于多种神经元功能（包括谷氨酸能突触）的基因集。

对下调的DEGs，基于STRING数据库构建了PPI网络。然后使用CytoHubba来探索PPI网络中的关键调节因子。CytoHubba中可用的12种算法中有9种将GRIN1和GRIA2识别为PPI网络中的前两个枢纽节点（图2d）。需要注意的是，GRIN1和GRIA2分别编码NMDAR的NR1亚基和AMPA选择性谷氨酸受体2。据报道，这两个基因的突变与神经发育障碍相关。通过RT-qPCR分析，研究者证实了与对照组相比，NMDAR1-Ab暴露的hFOs中GRIN1和GRIA2的表达降低（图2e）。

为确认RNA-seq结果的可靠性，研究者用从NMDARE患者或对照CSF中纯化的IgG抗体处理hFOs 24小时，RT-qPCR检测显示，患者CSF来源的IgG同样会导致GRIN1和GRIA2表达降低（图2f）。

图2.hFOs经NMDAR1-Ab暴露后的RNA-seq分析结果

03.受NMDAR1-Ab暴露影响的基因富集于神经精神疾病相关通路

为探索NMDAR1-Ab暴露与人类疾病的关联，研究者利用1312个下调的DEGs，通过DisGeNET数据库进行基因-疾病关联分析。结果显示，这1312个下调DEGs显著富集于多种脑部疾病，包括精神分裂症、失神癫痫、自闭症谱系障碍、智力残疾和双相情感障碍。值得注意的是，PPI网络中的核心枢纽基因GRIN1和GRIA2，均已被报道与多种神经精神疾病相关。

为进一步验证这一关联，研究者通过FUMA-GWAS工具进行分析，结果显示该组下调DEGs同样富集于与脑部疾病遗传相关的基因集，具体包括精神分裂症、认知能力、癫痫和神经质一般因子。上述结果共同表明，NMDAR1-Ab暴露可通过调控神经精神疾病相关基因的表达，参与NMDARE患者中神经精神症状的发生。

04.代谢组分析证实NMDAR1-Ab暴露后hFOs中谷氨酸水平降低

RNA-seq分析揭示了NMDAR1-Ab暴露对谷氨酸能突触的影响，后进行代谢组分析以检测NMDAR1-Ab暴露是否降低了hFOs中的谷氨酸水平。检测到的206种代谢物中，共有12种代谢物在NMDAR1-Ab暴露组和对照组hFOs之间存在差异表达。在这12种差异代谢物中，4种代谢物在NMDAR1-Ab暴露的hFOs中上调，L-谷氨酸在内的8种代谢物下调（图3a）。

KEGG通路分析显示，这12种差异代谢物与抗坏血酸和醛糖酸代谢、精氨酸生物合成和谷胱甘肽代谢等通路相关（图3b）。患者CSF来源IgG抗体的hFOs，也导致L-谷氨酸含量降低（图3c）。RNA-seq和RT-qPCR分析显示，NMDAR1-Ab暴露后hFOs中GLUD1和GLUL基因表达显著上调——这两个基因分别编码可将谷氨酸转化为α-酮戊二酸和谷氨酰胺的酶；而编码谷氨酰胺酶（催化谷氨酸生成的关键酶）的GLS基因，其表达在NMDAR1-Ab暴露后未发生改变，提示谷氨酸的生成过程未受影响（图3d）。

图3.NMDAR1-Ab暴露后的代谢组分析

05.NMDAR1-Ab暴露导致hFOs中神经元活动减弱

RNA-seq和代谢组学分析均提示，NMDAR1-Ab暴露会抑制hFOs的谷氨酸能功能。为明确该效应是否影响神经元电生理活动，研究者采用微电极阵列(MEA)技术进行检测。将培养至第110天的hFOs与10 μg/mL 单克隆NMDAR1-Ab或对照IgG共同孵育24小时后，MEA系统记录显示：与对照组相比，NMDAR1-Ab暴露组hFOs的峰电位数量显著减少，加权平均发放率明显降低，表明神经元活动减弱（图4a）。这一结果通过钙成像分析得到证实（图4b）。为确认该现象的临床相关性，研究者用从NMDARE患者脑脊液中纯化的IgG抗体处理hFOs，MEA检测显示患者CSF来源的IgG同样会导致hFOs神经元活动减弱（图4c）。上述结果表明，仅NMDAR1-Ab本身可导致hFOs神经元活动减弱，而非NMDARE患者体内观察到的神经元过度兴奋，提示患者体内的神经元过度兴奋可能由其他因素介导。

图4.NMDAR1-Ab暴露导致hFOs神经元活动减弱

06.患者CSF及去IgG患者CSF均诱导hFOs神经元过度兴奋

研究者进一步测试了患者CSF对神经元活动的影响。免疫染色分析显示，患者CSF显著降低了hFOs细胞表面NMDAR1的密度（图5a），但未改变神经元总密度。MEA和钙成像分析结果显示，与对照组相比，暴露于混合患者CSF的hFOs表现出神经元过度兴奋（图5b）。

鉴于此前已证实患者CSF来源的纯化IgG抗体（核心成分为NMDAR1-Ab）会导致神经元活动减弱，上述结果提示，患者CSF中诱导神经元过度兴奋的物质并非IgG抗体。为证实这一点，从患者CSF中去除IgG抗体，并用其上清处理hFOs，MEA分析显示，该组hFOs仍表现出神经元过度兴奋（图5c）。

综上，这些结果证实，患者CSF中导致神经元过度兴奋的关键物质并非NMDAR1-Ab，而是其他成分。

图5.NMDARE患者CSF及去除IgG的CSF引起hFOs神经元活动过度

07.患者CSF中激活的IL-17信号通路介导神经元过度兴奋

NMDARE患者常存在脑部炎症升高的情况，且炎症可调节神经元活动，因此推测患者CSF中促炎因子可能导致神经元过度兴奋。使用来自6名NMDARE患者和6名对照的CSF样本进行了Olink蛋白质组学分析。鉴定出14种差异蛋白，包括促炎因子IL-6和干扰素-γ（图6a）。值得注意的是，所有14种差异蛋白在NMDARE患者CSF中均上调。这14种上调的蛋白质在对外部刺激的正调控、T细胞激活和IL-17信号通路中富集（图6b）。

由于IL-17在驱动炎症中起关键作用，IL-17信号通路的激活可能表明NMDARE患者CSF中存在炎症。最近的一项分析显示，NMDARE患者CSF中包括IL-17、IL-6和IFN-γ在内的促炎因子含量显著高于对照组。鉴于IL-17可以诱导IL-6和IFN-γ的释放，IL-17信号通路的激活可能是导致神经元过度兴奋的根源。为了验证这一假设，用100 ng/mL的IL-17处理hFOs。RT-qPCR分析证实，IL-17暴露后，hFOs中IL-17信号通路的两个关键激活因子（ACT1和TRAF6）上调（图6c），表明IL-17信号通路被激活。随后的MEA和钙成像分析显示，与对照组相比，暴露于IL-17的hFOs表现出神经元过度兴奋（图6d-e）。为了进一步确认IL-17在神经元活动中的作用，将hFOs暴露于去除IgG的患者CSF（含或不含抗IL-17单克隆抗体）和去除IgG的对照CSF。后续MEA检测显示，中和IL-17可缓解去IgG患者CSF诱导的hFOs神经元过度兴奋（图6f）。这些结果表明，患者CSF中激活的IL-17信号通路是导致神经元过度兴奋的原因。

图6.患者CSF中激活的IL-17信号通路是神经元过度兴奋的原因

08.中和IL-17可减轻NMDARE患者CSF诱导的小鼠癫痫样行为

为在体内进一步验证IL-17信号通路对神经元活动的影响，通过微型渗透泵构建了脑室内输注NMDARE患者或非患病对照CSF的小鼠模型（图7a）。在输注后的前7天，注射对照CSF或患者CSF的小鼠均未出现癫痫样行为。

为诱导癫痫样表型，在第7天给小鼠腹腔注射阈下剂量的戊四氮（PTZ，一种癫痫诱导剂）。结果显示，在此剂量下，注射对照CSF+PTZ的小鼠未出现癫痫样行为，而所有注射患者CSF+PTZ的小鼠，在PTZ注射后5分钟内均表现出癫痫样行为。这表明，暴露于NMDARE患者CSF的小鼠比对照组更易诱发癫痫。

有趣的是，预先用抗IL-17单克隆抗体处理的小鼠，其癫痫样表型的严重程度显著降低（图7b）。这些结果进一步证实，激活的IL-17信号通路是导致神经元过度兴奋的关键原因。

图7.中和IL-17可减轻NMDARE患者CSF诱导的小鼠癫痫样行为

研究总结

本研究通过人脑类器官多组学分析，系统揭示了NMDARE的双重发病机制：

1.抗NMDAR1抗体通过内化NMDA受体、下调谷氨酸能突触功能，导致神经元活动减弱，可能与精神症状相关

2.IL-17信号通路的激活是引起神经元过度兴奋和癫痫样行为的关键因素

因此，靶向 IL-17 信号通路的干预手段，有望成为 NMDARE 的潜在治疗方向，在癫痫症状的针对性调控中更具应用潜力。后续仍需通过更多临床研究，进一步验证 IL-17 作为该疾病生物标志物与治疗靶点的临床价值。

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