文章标题：An orally-administered nanotherapeutics with gold nanospheres supplying for rheumatoid arthritis therapy by re-shaping gut microbial tryptophan metabolism

发表期刊：Journal of Nanobiotechnology

影响因子：12.6

百趣提供服务：微生物群落多样性测序（细菌16S）、AQ色氨酸代谢通路物质高通量靶标定量

研究背景

类风湿性关节炎（RA）是一种常见的慢性自身免疫性关节炎，影响全球数千万人。近年来，肠道微生物群在 RA 进展中的重要作用引起了人们的极大关注。

微生物衍生的色氨酸代谢产物参与多种疾病的进展，但其影响 RA 相关炎症与免疫功能障碍的机制及在 RA 发病及治疗中的确切作用尚未阐明。

金属纳米颗粒（MNPs）因其生物相容性、稳定性和低毒性具独特优势，尤其是金纳米颗粒（GNPs）有优异的抗炎和免疫调节特性，在各种 GNPs 中，金纳米球（GNS）是骨关节炎和骨质疏松症等疾病的有益调节剂。但在 RA 背景下，GNS 在重塑肠道微生物群落、影响色氨酸代谢的潜力研究不足，值得深入探索。

研究结果 

01- GNS 的合成与表征

对合成的 GNS 进行了全面的表征，以确定其结构和物理性质。扫描电子显微镜（SEM）图像显示出平均直径为约 60 nm的颗粒，表明 GNS 的高均匀性和最小聚集（图1A）。zeta 电位测量表明 GNS 在溶液中分散稳定，因为负电荷足以防止颗粒聚集（图1B）。后续细胞与动物的实验设计和方法如图1C所示，包括抗生素干预组（RA+ABX组）、粪便微生物群移植组（FMT（RA+GNS）组）和 AhR拮抗剂 CH-223191 干预组（RA+GNS+CH组）。

图1 GNS 的表征和随后的实验设计

02- GNS 以肠道微生物群依赖性方式缓解 CIA ，而 AhR 拮抗剂 CH-223191 则逆转了 GNS 的保护效应

为评估 GNS 对 RA 的影响，CIA 小鼠被随机分为 RA+GNS 组（0.01 mg/g bw/d GNS）和 RA+NS 组（等体积生理盐水）。结果显示，GNS 给药显著减轻 RA 严重程度，降低关节炎评分，具有显著保护作用（图2A）。

GNS 治疗显著减少滑膜增生和炎性浸润，维持关节间隙及软骨完整性，减轻 RA 病理变化（图2B-C）。TRAP 染色表明，RA+GNS 组破骨细胞活性和数量显著降低，骨侵蚀、骨吸收面积减少，溶骨活性受抑（图2D-E）。掌指关节三维重建显示其骨小梁更完整、侵蚀面积减小（图2F）；骨组织计量分析显示该组骨密度、骨体积/组织体积、骨小梁数量更高，骨小梁分离度更低，证实 GNS 改善关节骨破坏、缓解 RA 进展（图2G）。进一步研究显示，ABX 干预及 RA+GNS 组肠道菌群移植（FMT）后，小鼠 CIA 症状及关节、骨病变均得到显著改善，提示肠道菌群的作用。而使用 AhR 拮抗剂 CH-223191 则逆转了 GNS 的保护作用，表明 AhR 途径参与其疗效（图2A-G）。综上，GNS 通过促进肠道菌群稳态、富集色氨酸代谢物，激活 AhR 途径并改善肠道通透性，显著减轻 CIA 进展和严重程度。

图2 GNS 保护 CIA 小鼠免受 RA 诱导的关节损伤和骨侵蚀

03- GNS 逆转CIA小鼠肠道生态失调

通过16S rDNA基因测序检测了 GNS 治疗介导的肠道微生物群组成和结构的改变。在不同的治疗组中，肠道微生物群组成发生了显著变化（3A）。

GNS 降低了 Shannon 和 Chao 1 指数，而 AhR 拮抗剂 CH-223191 有效地逆转了这种变化（图3B-C）。功能预测结果显示，丙酮酸代谢、丙酸代谢和谷氨酸代谢在 GNS 处理下增强，但被 CH-223191 逆转（图3F）。

如图 3G-I 所示，门水平的微生物组成揭示了五种主要细菌的优势，包括厚壁菌门、拟杆菌门、弯曲杆菌门、脱硫杆菌门和放线杆菌门。F/B 比值是衡量肠道微生物群中厚壁菌门与拟杆菌门比例的指标，F/B 升高可作为RA中疾病改善的潜在指标，CH-223191 介导的该比率逆转与炎症加重相关（图3J）。

值得注意的是，疣状微生物群在 GNS 施用组中显著富集，并且随着 CH-223191 干预而减少（图3K）。此外，与 RA+NS 组相比，GNS 和 CH-223191 给药均显著调节了具有较高相对丰度的紧密乳杆菌属（Ligilactobacillus )，相关性分析显示 Ligilactobacillus 与 CIA 的严重程度呈负相关，进一步证明 Ligilactobacillus 的富集可能参与了 GNS 对 RA 的保护作用（图4）。

图3 GNS 介导的肠道微生物群组成和结构的改变

图4 GNS 和 CH-223191 调节的微生物组成和关键属

04- GNS 显著富集色氨酸代谢产物并被 CH-223191 转化

对 RA+NS、RA+GNS 和 RA+GNS+CH 三组小鼠的粪便进行了靶标色氨酸代谢组检测。结果表明（图5），三组间的粪便代谢物存在显著差异，关节炎评分与三种代谢物（IAA，IPA和烟酸）之间存在显著的负相关性，有趣的是，这些代谢物在 GNS 处理下显著富集，但在 CH-223191 干预下降低。

IPA 和 IAA 与关节骨密度显著正相关，表明它们可能有助于维持骨密度和骨骼完整性，而烟酸与关节骨密度的相关性则较弱。此外微生物组-代谢物组联合分析显示 Ligilactobacillus 与 IAA 和 IPA 呈显著正相关。总的来说，GNS 可能会通过改变肠道微生物群来减轻 CIA 的严重程度，特别是增加 Ligilactobacillus 的种类，这可能会导致 IPA 和 IAA 等色氨酸代谢物的富集，从而共同缓解 RA 的进展。

图5 GNP 处理改变了色氨酸代谢的概况

05-IPA/IAA混合物抑制MH 7A细胞中PTEN泛素化和降解对RA的抑制作用

MH 7A 细胞为与人 RA 患者滑膜细胞特征相似的人成纤维细胞样滑膜细胞系。实验显示，IPA/IAA 混合物处理对其有显著影响：CCK 8 试验表明其以浓度依赖方式抑制细胞增殖（图6A）；流式细胞仪分析显示凋亡细胞百分比增加，且多为晚期凋亡（图6B-C）；定量分析显示 EdU 阳性细胞比例低，进一步证实增殖受抑（图6D-E）；Transwell 分析表明其显著抑制细胞迁移和侵袭（图6F-H）。

RNA 测序显示，IPA/IAA 抑制与细胞迁移和粘附相关的基因表达（图7D-E），PI3K-AKT 为显著富集途径之一（7F-G），且处理组 PTEN 显著上调，与细胞增殖、迁移和侵袭受抑一致，提示其可能介导抗 RA 作用（图7H-I）。PTEN 可拮抗 PI3K-AKT 途径并抑制 NF-κB 信号。检测发现，IPA/IAA 显著提高 PTEN 表达，但不改变 p-PTEN 水平，表明其对 PTEN 的调节不通过磷酸化状态变化实现（图7O-P）。

IPA/IAA 混合物在 120 分钟时有效抑制 p65 磷酸化，60 分钟时显著抑制 IκBα 诱导磷酸化，表明其抗炎作用至少部分通过抑制 NF-κB 信号通路（图7K-N）。加入 PTEN 特异性抑制剂 VO-Ohpic 可部分逆转其对 p65 核转位的抑制，提示该混合物以 PTEN 依赖方式抑制 NF-κB 信号组分（图7Q）。机制研究显示，蛋白合成抑制剂 CHX 处理使 PTEN 蛋白水平在 4 小时轻微降低、8 小时显著降低，而 IPA/IAA 处理可防止 PTEN 降解并维持其水平，表明其可能稳定 PTEN 蛋白（图 7R-S）。免疫沉淀试验证实，IPA/IAA 处理减少 PTEN 泛素化，这可解释 PTEN 水平稳定（图 7T-V）。

综上，IPA/IAA 混合物的抗炎作用至少部分通过调节 PTEN/NF-κB 信号通路介导，即通过减少 PTEN 泛素化增强其表达，进而抑制 NF-κB 信号，减轻 MH 7A 细胞炎症反应。

图6 IPA/IAA 混合液可抑制 MH 7A 细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡

图7 IPA/IAA 混合物可通过上调 PTEN 的表达而显著抑制 NF-κB 信号通路

06-微生物色氨酸代谢产物在小鼠中表现出抗CIA作用

将 CIA 小鼠随机分为两组：IPA+IAA 组（500 mg/kg bw/d）和对照组（等体积的生理盐水）。结果表明，IPA/IAA 混合物显著减轻了 CIA 小鼠 RA 的严重程度，减轻了后爪肿胀，并降低了关节炎评分（图8A）。使用 H&E 和 TRAP 染色的组织学检查揭示了滑膜增生和炎性细胞浸润的减少，沿着骨侵蚀和吸收区域的显著减少（图8B-C、G-H）。Micro-CT 分析表明，施用 IPA/IAA 混合物显著改善了关节骨破坏，并减缓了 RA 的进展（图8D、I）。IHC 结果表明 IPA/IAA 处理显著降低了 p-p65 的表达并增加了 PTEN 的表达，这与体外实验一致（图8E-F、J-K）。

图8 IPA/IAA 混合物对 CIA 小鼠有明显的抗炎和保护作用

研究小结

GNS 显著改善了 CIA 的关节损伤和炎症，重塑了肠道微生态；GNS 富集了微生物来源的色氨酸代谢产物，如 IPA 和 IAA，通过激活 AhR 减少了 RA 相关的炎症和免疫反应。

GNS 介导的肠道微生物群和色氨酸代谢的调节代表了 RA 的新治疗策略，具有恢复免疫平衡和减少炎症的潜力。此研究弥合了理解肠道微生物群，色氨酸代谢和RA发病机制之间相互作用的关键差距，同时为 GNS 在自身免疫性疾病中的治疗潜力提供了机制见解。

微生物16S扩增子测序：基于二代测序平台靶向扩增微生物 16S rRNA 基因可变区，可高效解析样本中细菌 / 古菌的群落组成、物种丰度及分布差异；其通过提取样本总 DNA、靶向扩增目标片段、高通量测序等关键步骤快速获取菌群结构信息，广泛应用于肠道、土壤等各类含微生物样本研究，能为探究微生物与环境、宿主的互作关系（如肠道菌群与疾病、土壤菌群与作物生长）提供关键数据支撑。

AQ色氨酸代谢通路物质高通量靶标定量：色氨酸是一种必需氨基酸，参与人体蛋白质的合成，是重要的神经递质 5 - 羟色胺 (5-HT) 的前体，因此有助于促进良好的睡眠和对抗抑郁症。食物中的色氨酸在人或动物的肠道、肝脏和脑等组织代谢中产生犬尿氨酸、犬尿酸、5 - 羟色胺、褪黑素、吲哚及吲哚衍生物等多种代谢产物，参与了多种疾病的生理病理过程，包括抑郁症、炎症性肠病、类风湿关节炎等。