英文标题：GPR25 promotes the formation of lung and liver tissue-resident memory CD8 T cells

中文标题：GPR25促进肺和肝组织——常驻记忆CD8 T细胞的形成

发表期刊：Science Immunology

影响因子：16.3

 研究背景

组织驻留记忆CD8 T(TRM)细胞提供关键的抗病毒和抗肿瘤免疫，但指导其发展的分子途径尚未完全确定。

研究团队发现G蛋白偶联受体GPR25是由转化生长因子-β(TGF-β)信号诱导的TRM细胞形成的调节剂。研究结果表明，调节GPR25功能可能为改善感染和癌症中的TRM细胞反应提供一种治疗策略。

研究结果

01-TGF-β诱导CD8 T细胞中GPR25的表达

免疫细胞表达、eQTLs和表观基因组学数据库的分析证实，与非TRM细胞亚群和循环CD8 T细胞亚群相比，GPR25和TRM细胞相关基因在肺TRM细胞中显著富集(图1A-B)。TGF β处理可快速诱导原代人CD8 T细胞中GPR25的表达，这些细胞通过抗CD3和抗CD28 抗体在体外多克隆激活（图1C）。与非TRM细胞相比，GPR25转录起始位点上游的三个区域（C1、C2和C3），在肿瘤浸润性TRM细胞中显示出突出的转座酶可及峰（ATAC-seq峰），表明GPR25的表达可能受到这些信号通路的共同调节（图1D）。

与在人T细胞中观察到的类似，在体外通过TCR和CD28交联激活的小鼠CD8 T细胞中，TGF-β有效诱导Gpr25的表达，但其表达水平随时间逐渐下降（图1E）。此外，在未处理的野生型C57BL/6小鼠中，表达 TRM细胞标记物CD69的小肠上皮内淋巴细胞（siIELs）和肝脏 T细胞等非淋巴器官中的CD8 T细胞表达更高水平的Gpr25转录物，而脾CD8 T细胞显示出最小的Gpr25表达（图1F）。因此，在小鼠和人类中，GPR25是TGF-β诱导基因，在TRM细胞中选择性表达。

图1.TGF-β诱导GPR25在CD8 T细胞中的表达

02 -GPR25促进肝脏T_RM细胞的发育和维持

为评估GPR25在TRM细胞发育中的相对作用，在感染90天后比较脾脏、肝脏和siIEL室中转移的T细胞的细胞频率和记忆表型（图2A），发现相同比例的GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T细胞（图2B）。正如预期的那样，肝脏TRM细胞（CD69+）共表达CXCR6，但缺乏CD103的表达，GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T细胞在siIEL室中TRM细胞的频率没有显著差异（图2C），这表明Gpr25对于siIEL室中TRM细胞的发育是不可缺少的。

使用异体共生实验来评估GPR25-WT和GPR25-KO肝脏TRM细胞的驻留潜力（图2D）。共生30天后，GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T细胞在宿主肝脏中以相同比例积累，但在CD8-KO配对受体小鼠的脾脏中观察到GPR25-KO OT-I T细胞与GPR25-WT OT-I T细胞的比例明显更高（图2E）。因此，组织中缺乏GPR25的T细胞表现出降低的驻留潜力，更有可能重新进入循环，这表明GPR25支持肝脏TRM细胞的发育。

图2.GPR25促进肝脏TRM细胞的发育

03 -Gpr25缺乏会损害T_RM细胞发育的早期阶段

为评估GPR25是否影响TRM细胞发育的早期阶段，通过比较比较LCMV-OVA感染后肝脏中过继共转移GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T细胞在早期时间点的表型（图3A），感染后的48小时内观察到细胞的激活和增殖状态没有差异（图3B），感染后的第5天、12天和30天，细胞的比例相等，Gpr25缺乏对肝脏中转移的OT-I T细胞的KLRG1+效应表型没有可测量的影响，少量转移的OT-I T细胞共表达肝脏TRM细胞标志物CD69和CXCR6。

然而，在感染后第12天观察到肝脏中存在明显的CD69+CXCR6+OT-I T细胞群，表明潜在的TRM前体细胞的形成（图3C-E）。Gpr25缺陷导致这些TRM前体细胞减少，肝脏中KLRG1+效应细胞相应增加（图3D）。然而，脾脏中CD69+CXCR6+ OT-I T细胞的频率非常低，GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T细胞在任何时间点上均无显著差异（图3E）。这些发现表明，gpr25缺陷T细胞产生肝脏TRM细胞的受损不太可能是由于脾脏TRM前体细胞频率的改变。

图3.Gpr25缺乏损害TRM细胞发育的早期阶段

04 -GPR25支持干细胞样T_RM细胞的产生

差异基因表达分析显示肝脏GPR25-WT和GPR25-KO TRM细胞的转录谱存在显著差异（图4A）。与GPR25-KO TRM细胞相比，GPR25-WT TRM细胞对干细胞样T细胞特征表现出阳性富集，对效应物相关特征的富集程度降低（图4B）。对肝脏组织驻留记忆T细胞（TRM）进行无监督亚群分析，发现存在异质性亚群：主要簇1和3富含干细胞样特征及相关基因（Tcf1和Lef1），而簇0和2则富含效应基因（如Klrg1、Prf1、Gzma、Gzmb和GzmK）（图4C-E）。RT-qPCR和细胞内染色证实，GPR25-WT中TCF1编码的转录本和TCF1蛋白水平高于GPR25-KO肝TRM细胞（图4F-G）。

使用继发性转移方法来确定Gpr25缺陷是否影响肝脏中继发性TRM细胞的产生（图4H）。感染30天后观察到肝脏中转移的GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T细胞数量大致相等（图4I），表明GPR25-KO TRM细胞在肝脏中迁移和产生记忆T细胞的能力没有重大缺陷。

然而，与GPR25-WT TRM细胞相比，GPR25-KO TRM细胞在肝脏中分化为继发性TRM细胞（CD69+CXCR6+）的频率显著降低（图4J）。

相比之下，效应记忆T细胞（TEM）（KLRG1+CD62L−CD69−）的频率增加（图4K）。这些结果表明，GPR25-KO TRM细胞在抗原再激发后分化为次级TRM细胞的能力存在缺陷。

图4.GPR25促进干细胞样TRM细胞的发育

05 -GPR25增强T细胞对TGF-β的应答

与受体小鼠肝脏中的GPR25-KO TRM细胞相比，GPR25-WT TRM细胞中TGF-β特征基因正富集（图5A）。缺乏TGF-β受体29（Tgfbr2）的表达没有改变，但在肝脏TRM细胞中TGF-β受体1（Tgfbr1）的表达增加（图5B）。评估TGF-β信号在LCMV病毒感染模型中的作用（图5C）。阻断TGF-β信号通路在LCMV-OVA感染前后30天显著减少了肝脏中过继转移的CD69+CXCR6+的OT-1T细胞的频率，而不改变第30天时在肝脏中积累的OT-1T细胞的总数（图5D）。研究发现，与GPR25-WT CD8 T细胞相比，GPR25-KO细胞中磷酸化的SMAD2和SMAD3蛋白（pSMAD2/SMAD3）的表达水平显著降低（图5E）。

此外，在CD8 T细胞中过表达Gpr25则表现出更高水平的pSMAD2/SMAD3（图5F）。利用已发表的来自体外TRM细胞分化模型的RNA-seq数据集首次发现维甲酸（retinoic acid，RA）不会诱导T细胞中Gpr25的表达，而是抑制TGF-β诱导的Gpr25的表达（图5G）。接下来，在这个体外模型中评估了RA是否可以在缺乏Gpr25的情况下驱动TRM细胞分化（图5H）。正如预期的那样，与GPR25-WT T细胞相比，在TGF-β处理的条件下，GPR25-KO CD8 T细胞向CD69+CD103+TRM样细胞的分化受损（图5I）。

图5.GPR25增强T细胞对TGF- β的应答

06 -GPR25促进肺T_RM细胞的发育

采用LCMV-OVA感染幼稚CD45.1受体小鼠（图6A），在肺中观察到GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T细胞的比例大致相等（图6B）。感染30天后，在肺部检测到不同的CD69+CD103+OT-ITRM细胞群，与Gpr25充足的OT-I T细胞相比，缺乏Gpr25的OT-I T细胞在肺部发育为CD69+CD103+TRM细胞的能力降低（图6C）。

为进一步了解GPR25促进肺中CD69+CD103+TRM细胞发育的机制，通过对GPR25-WT和GPR25-KO OT-I记忆T细胞进行了单细胞转录组分析，OT-I T细胞分为两个主要亚群，在第0簇中观察到GPR25-WT与GPR25-KO OT-I记忆T细胞的比例更大（图6D）。与在肝脏TRM细胞中的发现类似（图4A-D），富含GPR25-WT T细胞的第0簇细胞相对于第1簇显示出效应相关基因表达减少，而干细胞样标记的表达增加（图6E-F）。此外，簇0显示出TRM细胞特征的强富集（图6G），表明它主要由TRM细胞组成，与簇1相反（图6D）。为验证这些发现，通过GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T细胞将CD8-KO受体小鼠分成不同的队列，然后用LCMV-OVA感染它们（图6H）。如预期那般，在转移的GPR25-WT OT-I T细胞中，肺中TCF1+CD69+ CD8 T细胞的频率明显高于GPR25-KO OT-I T细胞（图6I）。通过RT-qPCR分析证实，LCMV感染后第30天，GPR25-KO OT-I细胞中的Zeb2和S1pr5转录物水平显著升高（图6J）。

图6.GPR25促进肺TRM细胞的发育

07 - Gpr25缺陷T细胞不能控制肺转移 

为评估Gpr25缺陷记忆T细胞是否在肿瘤攻击模型中表现出受损的继发性肺T细胞反应，按图6A所示，感染30天后使用B16F10-OVA肿瘤细胞刺激受体小鼠以诱导转移（图7A）。接种13天后，GPR25-WT OT-I细胞在肺中的出现频率显著高于GPR25-KO OT-I细胞（图7B）。因此假设Gpr25-充足的OT-I记忆T细胞具有更大的控制肺转移的能力。为验证该假设，两组独立的CD45.1 WT受体小鼠（图 7C）分别接受GPR25-WT OT-I T细胞或GPR25-KO OT-I T细胞输注，随后经气管内感染LCMV-OVA。感染30天后使用B16F10-OVA细胞进行激发，并在FTY720处理后评估肺转移程度。结果显示，与接受GPR25-KO OT-I细胞的小鼠相比，接受GPR25充足的OT-I细胞的小鼠的转移结节数量显著减少（图7D）。

为排除宿主CD8 T细胞的干扰，采用CD8-KO小鼠作为受体，验证GPR25-WT OT-I T细胞与GPR25-KO OT-I T细胞在控制肺转移中的作用（图 7E）。对照组设置为未接受T细胞输注的CD8-KO小鼠，以专门评估过继转移OT-I T细胞的作用。结果显示，接受GPR25-KO OT-I T 细胞的CD8-KO小鼠存活结局较差，死亡率达50%；而接受GPR25-WT OT-I细胞的CD8-KO小鼠在分析时大多数存活（图7F）。此外，与接受GPR25-KO OT-I细胞或不转移OT-I细胞的CD8-KO小鼠相比，接受GPR25-WT OT-I细胞的CD8-KO小鼠的转移结节数量显著减少（图7G）。

图7.Gpr25缺陷T细胞不能控制肺转移

研究总结

在转录组学调查中，与非TRM细胞相比，GPR25成为肺和肿瘤浸润性CD8 TRM细胞中差异表达最多的基因之一。

研究发现GPR25在人CD8 T细胞中通过TGF-β信号诱导表达。LCMV感染模型证明了GPR25在支持小鼠肝脏和肺中表达TCF1的干细胞样TRM细胞的发育中发挥关键作用，而不是在siIEL室发育的干细胞。使用TRM生成的其他组织特异性模型的未来研究可用于检查GPR25在组织室中的作用。鉴于TRM细胞在抗肿瘤免疫应答中的重要性，推断通过靶向GPR25活性来调节TRM细胞应答的方法可能在相关的临床环境中有希望。

单细胞转录组测序：是在单个细胞水平进行高通量测序的技术，能够有效解决细胞异质性，有助于发现新的稀有细胞类型，深入了解细胞生长过程中的表达调控机制。利用微流控系统通过序列标签（barcode和UMI）区别群体中的不同细胞和转录本，获得单细胞水平的基因表达谱。