英文标题：Short-chain fatty acids enhance muscle mass and function through the activation of mTOR signalling pathways in sarcopenic mice

中文标题：短链脂肪酸通过激活 mTOR 信号通路，改善肌少症小鼠的肌肉质量与功能

发表期刊：Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle

 影响因子：9.1

客户单位：香港中文大学

百趣提供服务：转录组测序、短链脂肪酸高通量靶标定量

研究背景

肌少症是一种与年龄相关的肌肉疾病，其特征是肌肉量减少、力量下降和运动能力减退，会导致更高的骨折率、死亡率及其他不良临床结局。

有证据表明，肌少症老年患者体内有益的肠道微生物代谢产物——短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs）水平降低。

本研究通过临床前模型探究，补充 SCFAs 能否作为肌少症的有效治疗策略。

研究结果

肌少症老年小鼠的肠道菌群组成及短链脂肪酸干预后短链脂肪酸、脂多糖与结肠炎症因子的变化

通过 16S rDNA 测序分析肠道菌群，发现肌少症模型小鼠 SAMP8 与抗衰老小鼠 SAMR1 的肠道菌群 β 多样性存在显著差异，α 多样性无明显差异（图 1A）；SAMP8 小鼠 Lachnospiraceae 科（及 Anaerostipes 属）丰度较高，Erysipelotrichaceae 科和 Lactobacillaceae 科丰度较低，而 SAMR1 小鼠的菌群丰度特征相反（图 1B）。

血清 SCFAs 检测显示，SAMR1 小鼠血清丁酸盐浓度显著高于 SAMP8 小鼠；经 SCFAs 干预后，SAMP8 小鼠血清丁酸盐浓度恢复至与 SAMR1 小鼠相近水平，同时丙酸盐浓度较干预前显著升高（图 1C）。

结肠 HE 染色及炎症细胞计数显示，SAMP8 小鼠结肠黏膜中中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量显著多于 SAMR1 小鼠，SCFAs 干预后炎症细胞浸润明显减少（图 1D）。

RT-qPCR 检测显示，SAMP8 小鼠结肠组织 IL-1β mRNA 表达显著升高，SCFAs 干预后该基因表达降低（图 1E）。

血清 LPS 检测显示，SAMP8 小鼠血清 LPS 水平显著高于 SAMR1 小鼠，提示其存在肠道屏障功能异常，而 SCFAs 干预可使 LPS 水平降低，改善肠道屏障功能损伤（图 1F）。

图1. SAMR1 与 SAMP8 小鼠肠道菌群特征及 SCFAs 干预后血清指标与炎症水平分析

SCFAs 干预后肠道功能相关指标及肠通透性蛋白的改善

通过 SCFAs 干预后，SAMP8 小鼠（SCFAs P8 组）血清丙酸盐浓度较对照组（CTL P8 组）显著升高，丁酸盐浓度达到与 SAMR1 小鼠（CTL R1 组）相近水平（图 1C）。

结肠炎症方面，SCFAs P8 组结肠组织中 il-1β mRNA 表达较 CTL P8 组降低，结肠黏膜中中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量显著减少（图 1D-E）。

肠道屏障蛋白检测显示，SCFAs P8 组结肠组织中 Muc2 和 Claudin1 蛋白表达较 CTL P8 组显著升高，Occludin 和 E-cadherin 蛋白表达无显著差异，同时血清 LPS 水平较 CTL P8 组降低，表明 SCFAs 可改善肠道屏障功能（图 1F, 2A-E）。

此外，免疫荧光染色清晰显示 Muc2、Claudin1 及 Occludin 在肠道组织中的定位，进一步证实 SCFAs 对肠道屏障的改善作用（图 2F）。

图2. 肠道屏障蛋白的水平与定位

SCFAs治疗后肌肉表型的变化

通过肌肉质量检测发现，SCFAs P8 组小鼠胫骨前肌（Tibialis Anterior, TA）湿重较 CTL P8 组显著增加，其他下肢肌肉湿重无显著差异（图 3D）。肌肉功能方面，SCFAs P8 组小鼠握力、腓肠肌（Gastrocnemius, GAS）离体收缩的颤搐力和强直力较 CTL P8 组显著提升，达到接近 CTL R1 组的水平（图 3B-C）。

跑步机耐力测试显示，SCFAs P8 组小鼠跑步距离和跑步时间显著延长，抗疲劳能力较 CTL P8 组提升（图 3E）。

肌肉糖原检测表明，SCFAs P8 组小鼠股四头肌（Quadriceps, QUA）肌肉糖原含量较 CTL P8 组提升，肝脏糖原含量在各组间无显著差异（图 3F）。值得注意的是，SCFAs 干预对小鼠体重、每日饮水量和食物摄入量无显著影响（图 3A）。

图3. CTL R1、CTL P8 和 SCFAs 处理的 P8 小鼠的肌肉表型

SCFAs干预对小鼠肌纤维特性的调节作用

肌纤维形态与类型分析显示，CTL R1 组小鼠 GAS 肌纤维横截面积（Cross-Sectional Area, CSA）最大，SCFAs P8 组 GAS 肌纤维 CSA 较 CTL P8 组显著增大，但仍低于 CTL R1 组（图 4A-C）。

MHC 染色结果表明，CTL P8 组小鼠 GAS 肌肉中 I 型（慢肌）和 IIa 型（快氧化肌）肌纤维面积占比较高，IIb 型（快肌）肌纤维面积占比较低；SCFAs 干预后，SCFAs P8 组 IIb 型肌纤维面积占比较 CTL P8 组显著升高，I 型和 IIa 型肌纤维面积占比无显著变化（图 4A, D）。

肌萎缩相关基因检测发现，SCFAs P8 组小鼠 EDL 肌肉中 atrogin1 和 murf1 mRNA 表达较 CTL P8 组显著降低，肌生成相关基因（myod、myog）mRNA 表达在各组间无显著差异（图 4E）。

图4. 肌纤维特征和基于肌肉转录组的组间功能注释

SCFAs干预调控肌肉功能与代谢的分子机制（体内实验）

TA 肌肉转录组测序结果显示，与 CTL P8 组相比，SCFAs P8 组有 49 个基因显著上调、17 个基因显著下调；KEGG 通路注释发现，差异基因主要富集于 HIF-1、AMPK、胰岛素和 mTOR 信号通路，此外还涉及催产素信号通路（图 4F）。

胰岛素生长因子（Insulin-like Growth Factor, IGF）相关基因检测显示，SCFAs P8 组小鼠 EDL 肌肉中 igf1、igf1r 和 igfbp3 mRNA 表达较 CTL P8 组显著升高，与 CTL R1 组水平相近（图 5A）。

AKT/mTOR 信号通路检测表明，SCFAs P8 组小鼠 TA 肌肉中 p-AKT（S473）、p-mTOR（Ser2481）磷酸化水平较 CTL P8 组显著升高，下游 S6K1 蛋白表达显著升高，4EBP1 磷酸化水平较 CTL P8 组显著降低（图 5B-C）。AMPK/PGC1α 信号通路方面，SCFAs P8 组小鼠 TA 肌肉中 p-AMPK（Thr172）磷酸化水平和 PGC1α 蛋白表达较 CTL P8 组显著升高；EDL 肌肉中线粒体生物发生相关基因 sirt1 mRNA 表达显著升高，nrf1 和 tfam mRNA 表达无显著差异；同时，SCFAs P8 组小鼠肌肉 mtDNA/nuDNA 比值较 CTL P8 组显著升高（图 6A-C）。

脂质代谢相关基因检测显示，SCFAs P8 组小鼠 EDL 肌肉中 pparδ mRNA 表达较 CTL P8 组显著升高，c/ebpα mRNA 表达无显著差异；GAS 肌肉染色显示，SCFAs P8 组肌内脂肪含量较 CTL P8 组显著降低（图 6D-E）。

图5. SCFAs 对胰岛素和 mTOR 信号通路的影响

图6. AMPK 活性、线粒体相关基因、肌肉脂肪和脂代谢基因的表达

SCFAs对C2C12肌细胞作用及机制（体外实验）

SCFAs 混合物（乙酸盐：丙酸盐：丁酸盐 = 60:25:15）以 0.5-4 倍标准浓度干预 C2C12 肌母细胞，未显著促进细胞增殖或产生明显毒性，仅高浓度（3-4 倍）组有细胞数量减少趋势（图 7A）。100 ng/mL LPS 可缩小 C2C12 肌管直径，而 SCFAs 能逆转该效应，且单独处理可增加肌管直径和核数（图 7B）。

基因层面，SCFAs 可降低肌管 atrogin1、murf1 mRNA 表达，升高 ppargc1α mRNA 表达，该趋势在 LPS 共处理组中同样存在（图 7C）；蛋白层面，SCFAs 可降低 p-FoxO3a（Ser253）磷酸化水平和 Atrogin1 表达，LPS+SCFAs 组 Atrogin1 较 LPS 组有 2 倍降低趋势（图 7D-E）。60 nM 雷帕霉素（mTORC1 抑制剂）可显著升高肌管死亡率，完全阻断 SCFAs 对肌管的促进作用（图 8A-B）。

蛋白检测显示，SCFAs 可升高 p-mTOR（Ser2481）磷酸化水平和 S6K1 总量，但不影响 p-S6K1（Thr389）、p-4EBP1（Thr37/46）磷酸化；Rapa+SCFAs 组 p-mTOR、p-S6K1 磷酸化水平降低，4EBP1 表达升高（图 8C-D）。LPS + 雷帕霉素联合实验进一步证实，SCFAs 对肌管的保护作用依赖 mTOR 信号通路。

图7. C2C12 成肌细胞的增殖、肌管结构、mRNA和蛋白的表达

图8. C2C12 肌管结构及蛋白表达

研究背景

本研究证明，细菌代谢产物短链脂肪酸（SCFAs）可减轻年龄相关的肌肉丢失和功能障碍，体内和体外实验均显示其作用涉及与蛋白质合成相关的 mTOR 信号通路，同时调控 AKT/mTOR/S6K1、AMPK/PGC1α 通路，并通过改善肠道屏障功能、抑制炎症、调节脂质代谢及促进线粒体生成发挥协同作用。

转录组测序：对细胞或组织在某一状态下的全部 RNA 进行测定，凭借新一代高通量测序技术，它能快速获取海量转录本序列，精准识别可变剪接、新转录本等关键信息。无论是助力基础研究探索基因功能，还是为临床诊断提供分子层面依据，转录组测序都是强有力的科研工具，为解锁生命奥秘、攻克健康难题带来更多可能 。 

短链脂肪酸高通量靶标定量：短链脂肪酸（SCFAs）是一类碳链长度为1-6个碳原子的有机脂肪酸，也称挥发性脂肪酸（VFA），主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸等。百趣生物基于GC-MS平台，采用内标法对乙酸、丙酸、丁酸等11种常见短链脂肪酸进行精准的定性定量分析，满足客户的科研需求。