英文标题：Spatial metabolomics reveals the spatiotemporal dynamics of sugars and anthocyanins during Lycium ruthenicum fruit ripening

中文标题：空间代谢组学揭示黑果枸杞果实成熟过程中糖类与花青素的时空动态变化

发表期刊：Journal of Future Foods

影响因子：10.6

合作单位：安徽农业大学

百趣提供服务：植物NGM 2 Pro、空间代谢组学

研究背景

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)是分布于我国西北荒漠地区的药食同源灌木，其果实富含花青素、多糖等多种活性成分。其中，可溶性糖决定其风味，花青素则主导其色泽与营养价值，二者共同构成了其卓越抗氧化能力的物质基础。另外，这些关键代谢物在果实内的空间分布规律也直接关联着色泽均匀度、风味形成及采后品质。然而，传统研究多依赖组织匀浆分析，虽能利用LC-MS/MS测定总量，却无法揭示其在果皮、果肉等不同组织中的原位分布特征，限制了对果实品质形成机制的深入理解。随着组学技术的发展，空间代谢组学技术（特别是MALDI-MSI）为破解这一难题提供了全新方案。MALDI-MSI技术能对样本表面进行逐点扫描，实现代谢物的可视化精准定位，目前已在红枣、牡丹等果实研究中成功应用。尽管黑果枸杞的化学成分研究已较为深入，但其糖与花青素的空间分布规律仍是空白。为此，本研究结合MALDI-MSI与LC-MS/MS技术，旨在系统阐明黑果枸杞果实成熟过程中糖类与花青素的时空动态变化及其与抗氧化活性的关联，以期为精准调控果实品质、确定最佳采收期及优化采后保鲜策略提供科学依据。

研究结果

01.总多糖和花色苷含量

为明确黑果枸杞果实发育过程中关键活性物质的积累规律，本研究对其三个发育阶段(LR1、LR2、LR3)的总多糖及总花青素含量进行了定量分析（图1）。结果显示，两类活性物质的含量均随果实成熟呈现显著的上升趋势。在总多糖方面（图1A），其含量从幼果期(LR1)的4.06%持续攀升，至成熟期(LR3)达到峰值14.30%，增幅超过3.5倍。在总花青素方面（图2B），同样观察到了显著的积累效应，含量由LR1阶段的8.41mg/g稳步增长至LR3阶段的12.83mg/g。结合统计分析，不同发育阶段间的多糖与花青素含量差异均达到极显著水平。这就表明，多糖与花青素在黑果枸杞果实中的积累具有显著的发育阶段依赖性，两者含量均随果实成熟度的提高而同步增加。

图1.黑果枸杞果实不同发育阶段的总多糖含量和总花青素含量

02.黑果枸杞果实不同发育阶段的抗氧化能力分析

如表1所示，果实整体抗氧化能力随着其成熟而显著增强。具体而言，总抗氧化能力从LR1一直稳步提升至LR3。同样地，果实对DPPH和ABTS两种自由基的清除能力也表现出相似的增强规律。经统计分析证实，上述各项抗氧化指标在不同发育阶段间的差异均达到显著水平。即是说，黑果枸杞果实的成熟过程不仅是营养物质的积累过程，更是其抗氧化防御系统功能逐步完善和强化的过程，成熟果实展现出最强的自由基清除潜力。

表1.黑果枸杞不同发育阶段果实的总抗氧化能力、DPPH清除率和ABTS清除率

03.差异积累代谢物的代谢组学分析

为解析黑果枸杞果实发育过程中的代谢物变化规律，研究采用Student's t检验与PLS-DA联合分析，系统鉴定了黑果枸杞不同发育阶段的差异丰度代谢物(DAMs)。KEGG分析显示，76.57%的DAMs富集于代谢相关通路，表明代谢活动与果实发育阶段密切相关。其中，苯丙氨酸生物合成(5.94%)和类黄酮生物合成(5.24%)通路与花青素积累密切相关（图2A）。值得注意的是，花青素生物合成与果糖/甘露糖代谢通路间存在5个共有DAMs，暗示糖代谢与花青素合成之间存在潜在的代谢交互。

透过维恩图，研究进一步揭示糖类相关差异代谢物在各发育阶段的分布特征（图2B）。在鉴定的18个差异代谢物中，LR1 vs LR2比较组有5个共有代谢物，LR1 vs LR3比较组有1个共有代谢物，表明果实发育过程中存在部分代谢重叠。值得注意的是，松三糖、棉子糖、潘糖和1-蔗果三糖四种多糖类代谢物在三个发育阶段中均被稳定检出，而这些多糖此前已被证实与黑果枸杞的抗氧化活性密切相关。KEGG富集分析表明，这些共有DAMs显著富集于“淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、类黄酮及花青素生物合成”等关键通路，这些通路在黑果枸杞活性物质的合成与积累过程中发挥着核心调控作用，确保果实在不同发育阶段满足其生理需求。

图2.黑果枸杞不同发育阶段糖类与花青素的差异代谢通路及表达分析

04.不同发育阶段代谢物水平的比较分析

通过聚类热图分析（图2C-D），研究发现，花青素和碳水化合物代谢物在黑果枸杞果实发育过程中呈现出明显的阶段特异性分布模式。对于花青素，代谢组学共鉴定出49种花青素衍生物。其中，矢车菊素含量在LR3较其他阶段增加了1.14倍，而酰基化花青素仅在LR3阶段特异性积累，表明这两类成分可能协同参与了果实成熟过程中的色泽调控。值得注意的是，LR1检测到飞燕草素-3-葡萄糖苷等特征性花青素峰，这些物质与果实早期的防御反应密切相关，其可能与果实早期的防御响应有关。

碳水化合物方面，共鉴定出53种，其组成随发育阶段发生显著变化：LR1以单糖（葡萄糖、甘露糖）和磷酸化糖类为主；LR2以二糖（麦芽糖、纤维二糖）含量最高；LR3则以棉子糖家族低聚糖和糖醛酸衍生物占主导，可能参与着果实抗逆与风味形成。

层次聚类分析进一步揭示，LR1与LR2阶段的代谢模式表现出较高的相似性，两组在聚类热图中聚为同一分支，暗示着糖代谢与花青素生物合成在果实成熟过程中可能存在协同整合的调控关系。

05.黑果枸杞平均质谱分析

MALDI-MSI原始成像数据经SCiLS Lab软件处理，共推定注释到638个代谢物相关特征（图3），其中碳水化合物占6.6%，莽草酸及苯丙酸类化合物占19.7%（图4A）。糖类和花青素被确认为黑果枸杞果实的主要抗氧化活性成分，是决定其营养品质的关键物质基础。

图3.黑果枸杞不同发育阶段果实切片中代谢物的MALDI-MSI平均质谱图

通过分析不同发育阶段的MS1离子信号，研究发现，碳水化合物和莽草酸/苯丙酸类化合物随果实发育呈现明显变化（图4B），可为确认最佳采收期提供参考。值得注意的是，LR1与LR2在代谢组成和浓度上具有较高的一致性（图4C），表明这两个阶段之间的代谢差异相对较小；而LR3则表现出更为明显的代谢物积累特征，有着显著的代谢重编程。

图4.黑果枸杞不同发育阶段代谢物的定量、聚类及相关性分析

06.黑果枸杞碳水化合物的空间可视化

碳水化合物作为黑果枸杞的重要功能成分，在果实成熟过程中兼具自由基清除和能量底物供给的双重生理功能。通过横截面分析，明确该果实由外果皮、中果皮、内果皮和种子四层解剖结构组成（图5）。三个发育阶段的形态特征分别为：幼果期(LR1)，果皮各层和种子已分化完全；转色期(LR2)，果实显著膨大，中果皮增厚，种子发育完善；成熟期(LR3)，外果皮大量积累色素，中果皮高度肉质化，种子完全成熟。

图5. 黑果枸杞果实横切面

借助MALDI-MSI技术，研究还实现了糖类代谢物在果实不同组织中的原位空间分布可视化（图6），共注释出13种碳水化合物相关特征。空间分布分析显示，不同碳水化合物呈现显著的时空再分布模式：D-吡喃葡萄糖、松三糖和α-麦芽糖在LR2阶段主要富集于种子组织，至LR3阶段则均匀分布于整个果实；而LR1阶段的花萼和种子富集特征，暗示其可能存在韧皮部介导的运输以支持早期形态建成；相比之下，3,6-脱水-D-半乳糖、6-脱氧-L-甘露吡喃糖和D-阿拉伯糖酸则主要定位于中果皮和内果皮层，在外果皮和种子中几乎未检出。

图6.黑果枸杞果实结构表征及糖离子成像

07.黑果枸杞花青素与糖类的空间分布及代谢组学分析

通过MALDI-MSI质谱成像技术，研究推定注释出四种花青素衍生物（图7A），分别为Pelargonidin 3-glucoside(Pg3G)、Pelargonidin 3-rutinoside(Pg3R)、Pelargonidin 3-rutinoside-5-glucoside(Pg 3R5G)和Cyanidin 3-O-rutinoside-5-O-glucoside(Cy 3R5G)。从空间分布来看，花青素在整个发育过程中优先积累于表皮组织，种子中几乎检测不到。发育初期(LR1)花青素严格局限于外果皮，至转色期(LR2)逐渐向内果皮扩散，成熟期(LR3)近乎均匀分布于整个果皮，这种由外及内的扩散模式与果皮通透性改变及转运蛋白激活密切相关，是决定采后果实色泽均匀性的关键因素。另外，四种花青素的积累动态各异：Pg3G随发育持续积累，LR3达峰值；Pg3R呈LR1至LR2短暂下降后升高的双相变化；而Pg 3R5G和Cy 3R5G均在LR2即达峰值，随后趋于平稳或回落。

接着，研究采用HPLC对花青素组成进行定量分析，以飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素和天竺葵素四种标准品建立保留时间。结果显示，LR2和LR3阶段可检测到飞燕草素、矢车菊素和天竺葵素（图7B），矮牵牛素始终低于检测限。成熟期果实中三者含量分别为5.48、10.47和17.71 mg/g，矢车菊素型和天竺葵素型花青素是主要色素成分，其中矢车菊素积累与果色由绿红向深紫的转变高度相关，可作为关键成熟度标志物。

最后，借助非靶标代谢组学，花青素和糖类代谢物的相对丰度动态被进一步揭示（图7C-D）。花青素方面，Cy 3R5G在LR3积累量最低，而Pg3R随成熟显著增加。糖类方面，α-麦芽糖在整个成熟过程中持续下降，与淀粉降解为可溶性糖的过程吻合；潘糖在LR2达最高丰度，分别为LR1的4.14倍和LR3的2.43倍，呈先升后降的单峰模式。上述定量趋势与MALDI-MSI的空间分布模式具有显著的时空一致性，进一步证实了糖代谢与花青素合成之间的协同调控关系。

图7.黑果枸杞不同发育阶段花青素组成的可视化及花青素与糖含量的定量分析

研究总结

本研究以黑果枸杞果实为研究对象，综合运用MALDI-MSI空间代谢组学、HPLC定量分析及非靶标代谢组学等多技术手段，系统解析了果实三个发育阶段（幼果期LR1、转色期LR2、成熟期LR3）中碳水化合物与花青素两大类关键代谢物的时空分布与动态积累规律。研究通过空间成像技术首次实现了糖类及花青素在果实四层解剖结构（外果皮、中果皮、内果皮、种子）中的原位可视化，揭示了花青素由外果皮向心扩散至全果皮的着色模式，以及不同碳水化合物在种子、果肉等组织中的差异化富集特征。同时，HPLC定量分析明确了矢车菊素型和天竺葵素型花青素为黑果枸杞的主要色素成分，矢车菊素积累与果实色泽转变高度吻合，可作为关键成熟度标志物。三种独立分析方法（pH示差法、HPLC、MALDI-MSI）的结果在成熟期均达到峰值且相互印证，充分验证了研究结论的可靠性。该研究从空间代谢组学层面为阐明黑果枸杞果实品质形成的代谢调控机制提供了重要依据，也为确定最佳采收期及功能性产品开发奠定了科学基础。