文章标题：Sodium butyrate regulates macrophage polarization by TGR5/β-arrestin2 in vitro
发表期刊：Molecular Medicine
影响因子：8.3
研究背景
溃疡性结肠炎是高发的慢性结肠炎症性疾病，癌变风险高且缺乏有效根治手段，巨噬细胞极化失衡引发的肠道免疫紊乱是其核心发病机制，M1型巨噬细胞的促炎作用与M2型的抑炎修复作用失衡会加剧肠道炎症。丁酸钠作为肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸，已被证实可调控巨噬细胞极化、发挥肠道抗炎作用，但其具体的作用靶点与分子机制尚未明确。
TGR5作为表达于胃肠道和免疫组织的G蛋白偶联受体(GPCR)，β-arrestin2作为GPCR信号调控关键分子，二者均可独立参与肠道炎症的调控，且已有研究证实其通路能调控炎症反应，但该通路是否介导丁酸钠对巨噬细胞极化的调控、参与溃疡性结肠炎的炎症抑制仍未被阐明。基于此，本研究聚焦丁酸钠调控巨噬细胞极化的分子机制，探究TGR5/β-arrestin2通路在其中的作用，为溃疡性结肠炎的靶向治疗挖掘新的分子靶点与理论支撑。
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研究结果
01.丁酸的作用靶点为TGR5
研究先从PubChem数据库获取丁酸的SMILES为CCCC(=O)O（图1A），经SwissTargetPrediction数据库靶点预测，发现消化系统相关的 G 蛋白偶联胆汁酸受体1(GPBAR1，即 TGR5)为其潜在靶点（图1B）；后续通过SPR实验验证，证实固定在CM5传感芯片上的GPBAR1可与丁酸特异性结合，二者亲和常数为13.2 µM（图1C）。
图1.丁酸作用靶点的预测与验证
02.利用限制性蛋白水解质谱技术(Lip-MS)鉴定丁酸与TGR5的结合位点
研究通过LiP-MS探究丁酸与TGR5的直接结合位点，先将TGR5与丁酸/等体积溶剂于25 ℃共孵育，经蛋白酶K有限水解、胰蛋白酶酶解后，将样品上样至LC-MS/MS分析（图2A-B）。研究以火山图呈现54个检测肽段的序列信息（图2C），按FC＞2或＜0.5、padj＜0.05的标准筛选出6个差异肽段，其详细信息及统计结果见图2D。最终确定核心差异肽段为AVPVAMGLGDQR和IAYHPSSQSSVDDDLN，二者分别位于TGR5的275~286和321~330氨基酸区域，这两个区域即为丁酸与TGR5的潜在结合区。
图2.利用LiP-MS解析丁酸与TGR5的结合位点
03.TGR5与丁酸结合模式的计算分析
研究基于LiP-MS结果，因TGR5的321~330氨基酸区域位于蛋白末端，确定275~286区域为丁酸在细胞上的核心结合位点。通过分子对接分析二者相互作用（图3A），发现丁酸可与TGR5活性位点的精氨酸286、酪氨酸287形成强氢键，还能通过疏水端与精氨酸110、丙氨酸50发生疏水相互作用，助力二者形成稳定复合物。分子动力学模拟实验（图3B）中，RMSD曲线显示TGR5与丁酸在25ns左右趋于稳定且模拟末期收敛，RMSF曲线表明复合物仅少数氨基酸构象变化明显，结合能−26.352±7.838 kJ/mol，均证实体系稳定性。综合分析后明确，丁酸可与TGR5的天冬氨酸284、酪氨酸287形成有效氢键，氢键距离分别为1.7Å和2.0Å（图3C）。
图3.TGR5与丁酸结合模式的计算分析
04.RAW264.7细胞中丁酸钠逆转LPS对TGR5/β-arrestin2表达的抑制作用
TGR5作为G蛋白偶联受体，经STRING数据库验证可与G蛋白(GNB1)相互作用，该数据库未显示其与β-arrestin2存在相互作用（图4A）。研究通过蛋白免疫印迹实验，采用INT-777、SBI-115分别激动、抑制TGR5，并用siRNA-β-arrestin2敲低β-arrestin2，探究丁酸钠对该通路的影响，结果显示：LPS 可显著抑制TGR5、β-arrestin2表达，丁酸钠可逆转该抑制作用；SBI-115和敲低β-arrestin2均能抑制丁酸钠的调控作用，且后者效果更显著；单纯敲低β-arrestin2组加入INT-777后，TGR5、β-arrestin2表达显著回升（图4B–C）。
图4.丁酸对LPS处理后RAW264.7细胞TGR5/β-β-arrestin2通路的影响
05.LPS处理后SB经TGR5/β-arrestin2通路调控巨噬细胞极化
研究采用免疫荧光与qRT-PCR技术，探究SB通过TGR5/β-arrestin2通路对巨噬细胞极化的调控作用。结果显示，LPS组CD86、CD206荧光强度均升高，SB可降低LPS诱导的CD86荧光强度、上调其CD206荧光强度；与LPS+SB组相比，加入SBI-115或用siRNA-β-arrestin2转染细胞后，CD86荧光强度升高、CD206降低，而在此基础上加入INT-777则可逆转该变化（图5A-B）。qRT-PCR检测发现，IL-1β、iNOS、CD86的mRNA表达趋势与CD86荧光趋势一致，IL-10、ARG1、CD206的mRNA表达趋势与CD206荧光趋势一致（图5C-D）。
图5.LPS处理后丁酸钠通过TGR5/β-β-arrestin2通路调控巨噬细胞极化的作用
研究总结
本研究以溃疡性结肠炎发病相关的RAW264.7巨噬细胞为研究对象，通过靶点预测、SPR验证、限制性蛋白水解质谱技术结合分子对接与动力学模拟，首次证实TGR5是丁酸钠的直接作用靶点，其275~286氨基酸区域为核心结合位点，该区域的天冬氨酸284、酪氨酸287可与SB形成稳定氢键。体外细胞实验中，LPS可诱导巨噬细胞M1型极化并抑制TGR5/β-arrestin2表达，而丁酸钠能逆转该效应，促进M2型极化；进一步通路验证发现，TGR5拮抗剂SBI-115或敲低β-arrestin2可阻断SB的调控作用，TGR5激动剂INT-777则能逆转β-arrestin2敲低的抑制效应，明确SB通过激活TGR5/β-arrestin2通路在体外实现对巨噬细胞极化的调控，为溃疡性结肠炎的抗炎治疗提供了新的分子靶点与理论依据。
