文章标题：Gut Microbiota-Derived Butyrate Induces Epigenetic and Metabolic Reprogramming in Myeloid-Derived Suppressor Cells to Alleviate Primary Biliary Cholangitis

发表期刊：Gastroenterology

影响因子：25.1

客户单位：上海交通大学附属仁济医院

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

原发性胆汁性胆管炎(Primary Biliary Cholangitis, PBC)是常见的自身免疫性肝病，以胆管上皮细胞免疫介导性破坏为特征，会引发胆汁淤积、纤维化，最终发展为肝硬化。当前主要治疗手段是基于胆汁酸的疗法，如熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid, UDCA)，但20%-40%的患者对其生化反应不足，面临更高的死亡风险或肝移植需求。免疫失调在PBC发病机制中起关键作用，因此抑制炎症反应的干预措施可能是潜在的治疗方向。

髓源性抑制细胞(Myeloid-derived Suppressor Cells, MDSCs)作为未成熟髓系细胞的异质群体，在多种病理状态下调节免疫反应。它主要有两种亚型，即多形核MDSCs和单核细胞MDSCs。MDSCs能通过上调诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthetase, iNOS)、精氨酸酶1等介质的表达，产生活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，进而抑制T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的增殖。已有研究表明，MDSCs在自身免疫性疾病中发挥保护作用，且在PBC中，其积累与疾病严重程度呈负相关，暗示有效扩增功能性MDSCs可能是抑制PBC病理免疫反应的潜在策略。

肠道微生物群能产生多种功能性代谢物，如短链脂肪酸(Short-Chain Fatty Acids, SCFAs)、吲哚衍生物和胆汁酸等，对宿主免疫系统产生深远影响。已有研究发现，PBC患者的肠道微生物群组成和功能发生改变，例如产SCFAs的细菌种类减少，且SCFAs水平变化与PBC对胆汁酸螯合剂治疗的临床缓解相关。然而，肠道微生物群或其代谢物在PBC中对MDSCs稳态的调节作用及分子机制尚不明确。

研究概况

研究结果

01.丁酸盐水平与UDCA治疗反应、临床指标及MDSCs的相关性

作者测定了未经UDCA治疗的PBC患者粪便中SCFAs水平，发现该类患者粪便中乙酸、丙酸和丁酸盐水平存在显著的个体间差异，且PBC患者与健康对照(HCs)间的SCFAs水平无显著差异。对该类患者按Paris I标准后续分为UDCA应答者和无应答者后，无应答者的粪便丁酸盐水平显著低于应答者（图1B）。随后，作者通过流式细胞术检测了应答者与无应答者的MDSCs频率及功能，发现二者MDSCs频率无显著差异，但无应答者MDSCs的iNOS表达显著降低（图1E-F）；同时进行的相关性分析结果表明，粪便丁酸盐水平与PBC患者胆汁淤积相关指标（碱性磷酸酶、总胆红素）呈显著负相关（图1C-D），与MDSCs频率及产一氧化氮的MDSCs数量呈显著正相关（图1G-H），提示丁酸盐可能参与调节PBC中MDSCs的稳态。

图1.丁酸盐与PBC患者对UDCA的治疗反应及MDSCs丰度相关

02.丁酸盐特异性促进MDSCs的扩增及免疫抑制功能

作者从健康志愿者外周血单核细胞(PBMCs)中体外诱导生成MDSCs，并用不同浓度的丁酸盐进行干预，结果表明丁酸盐能以剂量和时间依赖的方式显著扩增人总MDSCs群体，且对多形核MDSCs(PMN-MDSCs)和单核细胞MDSCs两个亚型的扩增效果，均优于乙酸盐和丙酸盐。作者采用流式细胞术检测MDSCs的扩增频率及免疫功能指标（iNOS、ROS、精氨酸酶），并通过CFSE标记T细胞的共培养实验验证其免疫抑制活性，结果显示，丁酸盐处理后，MDSCs中免疫抑制相关分子的表达显著升高，且对CD4⁺/CD8⁺T细胞增殖的抑制作用显著强于乙酸盐、丙酸盐处理组及对照组（图2）。在小鼠骨髓(BM)细胞体外诱导实验中也得到类似结果，证实SCFAs中尤其是丁酸盐，可特异性促进MDSCs的扩增和免疫抑制活性。

图2.丁酸盐促进人体MDSCs的扩张和功能

03.丁酸盐诱导MDSCs发生FAO驱动的代谢重编程

为探究丁酸盐调控MDSCs的代谢机制，作者采用非靶标代谢组学分析MDSCs的代谢物变化，并通过RNA测序检测代谢相关基因的表达谱。结果显示，代谢组学分析表明丁酸盐处理后，MDSCs中线粒体脂肪酸氧化(FAO)通路显著富集（图3A）；RNA测序显示脂质代谢通路（含脂肪酸代谢）和PPAR信号通路显著富集（图3B），多个FAO相关基因（如CPT1A、ECHS1）表达上调（图3C），且RT-qPCR实验进一步验证了这些基因的mRNA表达升高（图3D）。

实验通过荧光标记棕榈酸(BODIPY FL C₁₆)和Mitotracker DeepRed探针检测发现，丁酸盐处理的MDSCs脂质摄取量显著增加，线粒体质量也明显升高，同时线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)水平显著增，但对糖酵解无显著影响。使用FAO限速酶CPT1A的特异性抑制剂依托莫司(etomoxir)处理后，上述脂质摄取、线粒体质量及OXPHOS的增强效应均被阻断（图3E-H）。这些结果表明，丁酸盐处理的MDSCs经历了以FAO驱动的OXPHOS上调为特征的代谢重编程。

图3.丁酸盐上调MDSCs中的脂肪酸氧化

04.PPARD依赖的脂肪酸氧化介导丁酸盐对MDSCs的免疫抑制功能调控

为验证FAO在丁酸盐调控MDSCs中的必要性，作者使用FAO限速酶CPT1A的特异性抑制剂 依托莫司处理人和小鼠MDSCs，同时通过shRNA敲低小鼠MDSCs中的Cpt1a基因以排除脱靶效应，结果显示，依托莫司可完全消除丁酸盐对MDSCs扩增及免疫抑制功能的促进作用，Cpt1a敲低也能显著减弱该效应（图4A-D）。

结合前文RNA测序结果（图3B），丁酸盐处理后MDSCs中PPAR信号通路与脂质代谢通路一同显著富集，提示PPAR家族可能参与丁酸盐的调控效应。进一步通过RT-qPCR验证发现，丁酸盐仅特异性上调MDSCs中PPARD的表达，对PPARA、PPARG无显著影响（图4E）；且使用PPARD抑制剂GW0660处理后，丁酸盐对MDSCs分化、免疫抑制分子表达及T细胞抑制活性的促进作用被显著逆转，同时CPT1A的表达也随之降低（图4F-H）。

上述结果表明，FAO和PPARD是丁酸盐调控MDSCs功能的关键环节，其中PPARD介导了丁酸盐对FAO通路的激活，而FAO是丁酸盐发挥作用的必需条件（图4）。

图4.脂肪酸氧化介导丁酸盐处理后MDSCs的免疫抑制功能增强

05.丁酸盐通过抑制HDAC3增强H3K27ac修饰，调控MDSCs的分化及功能

作者采用抑制剂干预结合表观遗传检测验证HDAC3的抑制效应，通过泛HDAC抑制剂、HDAC3特异性抑制剂处理MDSCs，并借助流式细胞术检测H3K27ac整体表达、CUT&Tag-seq分析全基因组乙酰化分布、ChIP-qPCR验证靶基因启动子区乙酰化富集。研究经¹³C标记丁酸盐的同位素示踪实验，发现其作为能量底物作用微弱；同时检测到MDSCs中GPR41、GPR43低表达，GPR109A表达无差异且其抑制剂无法逆转丁酸盐效应，证实丁酸盐作用不依赖能量底物或G蛋白偶联受体激活。

结果显示，泛HDAC抑制剂(SAHA、TSA)可模拟丁酸盐对MDSCs分化及免疫抑制功能的促进作用，上调PPARD、CPT1A表达（图5A-C）。HDAC3特异性抑制剂(RGFP966)能重现该效应，且丁酸盐对HDAC3已抑制的MDSCs无额外作用，证实HDAC3是关键靶点（图5D-E）。

此外，丁酸盐处理后MDSCs中H3K27ac水平显著升高（图5F），CUT&Tag-seq显示其全基因组水平增强（图5G）且富集于PPARD、CPT1A等FAO相关基因启动子区（图5H），ChIP-qPCR进一步验证该结果（图5I）。综上，丁酸盐通过抑制HDAC3增强H3K27ac介导的FAO相关基因转录，进而调控MDSCs的分化及免疫抑制功能。

图5.丁酸盐通过抑制HDAC活性促进MDSCs功能

06.丁酸盐及丁酸盐处理的MDSCs在体内缓解免疫介导的胆管炎

研究人员在2OA-BSA诱导的小鼠胆管炎模型中，通过饮用水补充丁酸盐，流式细胞术分析显示小鼠骨髓和肝脏中MDSCs的频率及iNOS水平显著升高，CD4⁺/CD8⁺T细胞频率降低；同时肝脏组织炎症改善，血清碱性磷酸酶(ALP)及TNF-α、IFN-γ、IL-6等促炎细胞因子水平下降（图6A-H）。而用抗Gr1抗体耗竭MDSCs后，丁酸盐的上述保护效应完全消失，证实其作用依赖MDSCs。

过继转移实验显示，仅丁酸盐处理的MDSCs（而非乙酸盐/丙酸处理的MDSCs或PBS对照组MDSCs）能显著减轻小鼠肝脏炎症；若MDSCs预处理FAO抑制剂依托莫司（抑制CPT1A）后再进行过继转移，其保护作用相较于单独丁酸盐处理的 MDSCs 显著减弱（图6I-L）。上述结果表明，丁酸盐通过调控MDSCs减轻小鼠免疫介导的胆管炎，而过继转移丁酸盐处理的MDSCs也具有显著治疗益处，且该保护作用依赖FAO通路。

图6.补充丁酸盐和丁酸盐-MDSCs在体内减轻免疫介导的胆管炎

07.UDCA无应答者MDSCs的功能与代谢缺陷及丁酸盐的修复作用

作者收集了经UDCA治疗至少12个月的PBC患者粪便样本和外周血样本，测定粪便丁酸盐水平。结果表明，无应答者粪便丁酸盐水平显著低于应答者（图7B）。

作者通过流式细胞术、Seahorse代谢分析及RT-qPCR检测了MDSCs的功能和代谢状态：流式细胞术分析显示，应答者与无应答者的MDSCs频率无显著差异（图7C），但无应答者MDSCs的免疫抑制功能显著受损，表现为iNOS、ROS、精氨酸酶的表达水平降低（图7D）；Seahorse代谢分析显示其氧化磷酸化(OXPHOS)和糖酵解活性显著降低（图7G），同时PPARD、CPT1A等FAO相关基因的表达水平减少（图7H）。

体外用丁酸盐处理后，不仅能促进PBC患者MDSCs的扩增和免疫抑制功能（图7I），还可显著恢复无应答者MDSCs的免疫抑制分子表达及对CD4⁺/CD8⁺T细胞增殖的抑制能力（图7J）。上述结果表明，丁酸盐补充可有效修复UDCA无应答者MDSCs的功能与代谢缺陷。

图7.治疗后UDCA无应答者的MDSCs的功能和代谢缺陷

研究总结

微生物群衍生的丁酸盐通过协调细胞表观遗传和代谢过程，促进具有强大免疫抑制功能的MDSCs的分化。丁酸盐在UDCA无应答者中含量降低，且与MDSCs频率和功能呈正相关。丁酸盐通过上调脂肪酸氧化(FAO)驱动的氧化磷酸化(OXPHOS)诱导MDSCs扩增和免疫抑制能力，该过程由PPARD特异性介导。丁酸盐作为HDAC3抑制剂，增强脂质代谢基因的H3K27ac修饰，进而促进MDSCs中的脂肪酸氧化过程。给予丁酸盐或过继转移丁酸盐处理的MDSCs，可有效减轻2OA-BSA诱导的小鼠免疫介导的胆管炎。脂肪酸氧化途径和线粒体活性缺陷，可能是UDCA无应答者MDSCs免疫抑制功能受损的重要原因，而丁酸盐处理可有效恢复其受损的免疫抑制功能。因此，微生物群衍生的丁酸盐可能是调节PBC免疫稳态的潜在治疗方法。