文章标题：Uridine restores oocyte quality and mitigates female reproductive aging by inhibition of ferroptosis in mice

发表期刊：nature communications

影响因子：18.1

客户单位：北京大学第三医院

百趣提供服务：MetPro-II 代谢物蛋白相互作用(Lip-MS)

研究背景

随着生育年龄推迟，高龄生育问题日益突出。女性衰老会造成卵巢储备降低、卵母细胞质量下降，显著增加不孕、流产以及子代异常风险。现有辅助生殖技术难以解决卵子本身的年龄相关损伤，临床成功率随母体年龄升高而下降，亟需开发延缓生殖衰老的干预策略。卵母细胞成熟高度依赖代谢稳态，衰老卵子常伴随代谢紊乱、线粒体损伤与氧化应激。尿苷作为嘧啶代谢关键代谢物，已被证实可以改善多种组织、干细胞衰老，但它在卵巢及卵母细胞衰老中的作用尚不明确。铁死亡是铁依赖的脂质过氧化所驱动的程序性细胞死亡，是介导卵母细胞老化的重要机制。目前可靶向调控卵母细胞铁死亡的代谢小分子仍有待挖掘。因此，本研究以老龄小鼠为模型，探究尿苷能否通过抑制铁死亡改善老龄小鼠卵母细胞质量，并解析其分子靶点，为高龄生育干预提供理论依据。

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研究结果

01.尿苷可提升老龄小鼠生育能力与卵母细胞成熟潜能

代谢紊乱会加速卵巢功能衰退、降低生育力。对已发表的卵巢代谢组数据重新分析发现，老龄小鼠卵巢、血浆中尿苷及其下游代谢物水平显著低于年轻小鼠（图1a）。

为探究尿苷的生殖保护效应，连续10天对老龄雌鼠进行梯度尿苷腹腔注射，年轻小鼠给予生理盐水作为对照；筛选得到10 mg/mL作为体内给药剂量（图1b）。实验证实，老龄小鼠体内尿苷本底水平低下，外源性补充能够有效恢复血浆与卵巢的尿苷浓度（图1cd）。

繁育实验表明，尿苷干预可显著改善老龄雌鼠的生育产出（图1ef）。超促排卵获取卵母细胞后可见：老龄小鼠排卵数量减少、第一极体排出率下降，卵母细胞碎片化、死亡比例上升；尿苷处理可逆转上述衰老相关表型（图1hj）。

卵母细胞核成熟相关检测结果显示，老龄小鼠卵母细胞普遍存在纺锤体结构紊乱、染色体错位问题，染色体非整倍体发生风险升高（图1ko）；尿苷补充能够明显纠正纺锤体与染色体的异常，修复老龄小鼠卵母细胞的核成熟缺陷。本研究以亚精胺作为阳性对照开展平行实验，进一步佐证尿苷可改善老龄小鼠卵母细胞质量，提升生育水平。

图1.补充尿苷对老龄雌性小鼠生育能力与体内卵母细胞成熟的作用

02.尿苷可提升老龄小鼠卵母细胞的受精潜能与早期胚胎发育能力

卵母细胞胞质成熟直接决定受精与胚胎发育能力，皮质颗粒(CGs)及其内含物ovastacin是阻断多精受精的关键物质。检测结果显示，尿苷干预可显著恢复老龄小鼠卵母细胞中CGs与ovastacin的荧光信号强度及动态分布（图2a–d）。 精子结合实验证实，尿苷能显著提高老龄小鼠卵母细胞透明带结合精子的数量（图2e-f）；体内受精、体外胚胎培养进一步证明，尿苷可显著提升老龄小鼠受精率与囊胚形成率（图2g–i）。

综上，尿苷通过修复皮质颗粒与ovastacin的正常动态分布，改善老龄小鼠卵母细胞胞质成熟缺陷，进而增强卵子受精能力、促进早期胚胎发育。

图2.补充尿苷对老龄小鼠卵母细胞受精能力与早期胚胎发育的作用

03.尿苷可改善老龄小鼠卵母细胞的体外成熟效果

基于体内实验结论，设置10、50、100、200 μM尿苷浓度梯度开展卵母细胞体外培养筛选，100 μM尿苷可显著恢复老龄小鼠卵母细胞第一极体排出率，确定为最优体外作用浓度（图3ab）；平行对照实验证实鸟苷、腺苷无修复效果，提示该保护作用为尿苷特异性。免疫荧光检测显示，第二次减数分裂中期(Metaphase Ⅱ, MII)，老龄小鼠成熟卵母细胞存在纺锤体紊乱、染色体错位、非整倍体高发的问题（图3c、f），定量统计证明100 μM尿苷能显著降低上述三类异常的发生比例（图3de、g）。

综上，尿苷通过稳定纺锤体与染色体结构、保障染色体数目准确，有效改善老龄小鼠卵母细胞体外成熟缺陷。

图3.补充尿苷对老龄小鼠卵母细胞体外成熟的影响

04.转录组分析揭示尿苷调控老龄小鼠卵母细胞的分子通路

为阐明尿苷改善老龄小鼠卵母细胞质量的分子机制，本研究对年轻小鼠、老龄小鼠、尿苷干预老龄小鼠的MII期卵母细胞开展转录组测序分析（图4a）。测序结果显示，老龄与年轻小鼠卵母细胞存在显著的基因表达差异，共筛选出2445个差异表达基因，包含1306个上调基因与1139个下调基因；而尿苷干预可逆转417个衰老相关基因的异常表达，有效重塑老龄小鼠卵母细胞的转录组特征，使其部分趋近于年轻小鼠卵母细胞（图4b–d）。

研究通过KEGG通路富集与GO功能注释分析挖掘核心调控通路（图4e–h）。KEGG分析表明，老龄小鼠卵母细胞的异常高表达基因主要富集在铁死亡、线粒体自噬通路，而尿苷干预可显著抑制这两条衰老相关通路的基因表达，同时上调线粒体氧化磷酸化通路基因（图4e-f）。GO功能分析进一步证实，尿苷可修复老龄小鼠卵母细胞多项受损生理功能，涵盖氧化应激应答、铁离子稳态、脂质代谢、氧化磷酸化、细胞周期调控及DNA损伤修复等过程（图4g-h）。

GSEA分析进一步验证上述结论：老龄小鼠卵母细胞中衰老特征SenMayo通路与铁死亡通路被显著激活，存在明显的衰老转录特征，尿苷处理可有效削弱两条通路的富集程度，缓解卵母细胞衰老（图4i）。研究进一步对尿苷逆转的衰老相关差异基因开展富集分析，针对171个尿苷下调、118个尿苷上调的修复型基因分析显示，尿苷可靶向抑制铁死亡关键基因(Fth1、Ftl1、Map1lc3b)，并激活线粒体氧化磷酸化核心基因(mt-Atp6、mt-Cox3、Ppa1)。

综上，本研究明确了尿苷的分子调控机制，提出核心假说：尿苷通过抑制卵母细胞铁死亡、修复线粒体功能紊乱，有效改善老龄小鼠卵母细胞的质量与发育潜能。

图4.转录组分析证实尿苷可缓解老龄小鼠卵母细胞铁死亡与线粒体功能障碍

05.尿苷可缓解老龄小鼠卵母细胞铁死亡，并维持线粒体正常功能

已有研究证实铁死亡是卵母细胞衰老的核心驱动机制，本研究转录组结果表明，尿苷可显著抑制老龄小鼠卵母细胞中铁死亡通路的过度激活（图4f、i）。为验证该机制，本研究检测了铁死亡与氧化应激关键指标：老龄小鼠卵母细胞Fe²⁺含量异常升高、ROS大量蓄积，氧化稳态失衡，而尿苷干预可有效降低Fe²⁺与ROS水平，缓解氧化损伤（图5a–d）。

脂质过氧化是铁死亡的标志性特征，BODIPY 581/591染色结果显示，老龄小鼠卵母细胞G/R比值显著升高，脂质过氧化损伤加剧，尿苷可有效逆转该异常（图5e-f）。抗氧化指标检测发现，老龄小鼠卵母细胞存在GSH耗竭、GSSG堆积、GSH/GSSG比值降低的氧化紊乱表型，尿苷处理可恢复二者比值，修复卵母细胞氧化还原稳态（图5g–k）。

本研究通过铁死亡激活剂RSL3回补实验验证机制：5 μM RSL3处理可降低卵母细胞第一极体排出率，并抵消尿苷对脂质过氧化的修复作用，证实尿苷改善老龄小鼠卵母细胞成熟能力的作用依赖于抑制铁死亡。

线粒体功能损伤是ROS过量生成的主要原因，线粒体功能检测结果显示：年轻卵母细胞线粒体均匀分布且富集于纺锤体周边，而老龄小鼠卵母细胞线粒体弥散紊乱、异常率升高，尿苷可有效修复其分布缺陷（图5l-m）。JC-1检测证实老龄小鼠卵母细胞线粒体膜电位显著降低，尿苷可部分恢复膜电位，改善线粒体功能障碍（图5n-o）。

过量ROS引发的氧化应激会诱导DNA损伤与早期凋亡，γH2AX、Annexin-V染色结果表明，老龄小鼠卵母细胞DNA损伤与凋亡水平显著升高，尿苷可明显缓解上述损伤表型（图5p–s）。此外，线粒体复合体I抑制剂鱼藤酮干预可逆转尿苷对卵母细胞成熟及线粒体功能的修复效果。

综上，本部分机制实验证实：尿苷可通过抑制铁死亡、缓解氧化应激、修复线粒体结构与功能损伤，减少卵母细胞DNA损伤与早期凋亡，有效改善老龄小鼠卵母细胞质量与体外成熟能力。

图5.补充尿苷对老龄小鼠卵母细胞铁死亡、线粒体功能、细胞凋亡及DNA损伤的影响

06.尿苷直接靶向PCBP1，抑制老龄小鼠卵母细胞铁死亡并维持线粒体功能

本研究采用LiP-SMap技术筛选尿苷在老龄卵巢中的靶蛋白（图6a），得到2953种蛋白，筛选285条差异肽段用于蛋白构象分析（图6b）。GO富集结果提示候选蛋白关联嘧啶核苷结合、铁死亡调控、线粒体分布相关生物学过程，与转录组结果吻合（图6c），筛选出铁稳态关键蛋白PCBP1作为核心靶点。

分子对接、100 ns分子动力学模拟、MM/GBSA结合能计算及SPR亲和力实验共同证实，尿苷可稳定结合PCBP1，二者相互作用亲和力强、复合物构象稳定。

蛋白免疫印迹显示老龄小鼠卵母细胞PCBP1表达显著降低，尿苷可恢复其表达（图6d）。敲低Pcbp1会升高卵母细胞ROS、游离Fe²⁺与脂质过氧化水平，诱发铁死亡；同时造成线粒体分布紊乱、膜电位下降，加剧DNA损伤与凋亡，引发纺锤体、染色体异常，大幅提升非整倍体比例（图6e–w）。

综上，尿苷通过靶向结合并稳定PCBP1，抑制卵母细胞铁死亡、改善线粒体功能，保障老龄小鼠卵母细胞减数分裂正常进行。

图6.尿苷靶向PCBP1抑制老龄小鼠卵母细胞铁死亡、维持线粒体功能与减数分裂完整性

研究总结

本研究系统解析了尿苷改善老龄小鼠卵母细胞质量的分子机制。转录组分析提示，尿苷可抑制老龄小鼠卵母细胞铁死亡过度激活，缓解线粒体功能紊乱。表型实验证实，尿苷能够降低卵母细胞内游离铁、活性氧及脂质过氧化水平，恢复谷胱甘肽氧化还原稳态，改善线粒体分布与膜电位，减轻DNA损伤、早期凋亡与减数分裂染色体异常。机制上，PCBP1为尿苷直接结合的核心靶蛋白；老龄小鼠卵母细胞PCBP1蛋白水平显著下调，尿苷可结合并稳定该蛋白；敲低Pcbp1则会诱发卵母细胞铁死亡、线粒体损伤与减数分裂缺陷。尿苷通过靶向并稳定PCBP1蛋白，抑制铁死亡、缓解氧化应激、维持线粒体稳态，保护老龄小鼠卵母细胞减数分裂完整性，为高龄女性卵母细胞质量改善提供新的靶点与干预思路。