文章标题：Gastrointestinal Environment Intelligent-Responsive Nanozyme for the Treatment of Multidrug-Resistant Helicobacter pylori Infection
发表期刊：Small
影响因子：12.1
客户单位：陕西科技大学
百趣提供服务：微生物多样性测序
研究背景
幽门螺杆菌作为可耐受胃酸的致病菌，全球人群定植率超50%，是胃炎、消化性溃疡的主要诱因，长期感染还可能引发胃癌，根除它可显著降低胃部疾病发病与复发风险。当前临床一线采用质子泵抑制剂/铋剂联合两种抗生素的三联疗法，但耐药菌株增多导致疗效下降，且大剂量抗生素会破坏肠道菌群稳态、引发副作用，同时无法缓解感染诱发的炎症反应。虽有纳米载体可提升抗生素递送效率，却仍未解决抗炎与菌群保护问题，因此亟需高选择性、无耐药性、兼具抗炎效果的非抗生素治疗方案，为多重耐药幽门螺杆菌感染治疗破局。
研究概览
研究结果
01.CeOSL的制备与表征
本研究通过3'-唾液酸乳糖的羧基/羟基与三价铈离子络合，再以2-甲基咪唑调节pH值进行氧化自组装，制得CeOSL（图1a）；其透射电子显微镜图像（图1b）显示CeOSL为纳米网状结构，表面分布有大量3'-唾液酸乳糖颗粒，对120个颗粒进行粒径统计分析，确定其平均粒径约2.23 nm，均匀分布于氧化铈表面（图1c）。X射线衍射图谱（图1d）表明CeOSL保持萤石立方相氧化铈晶体结构，衍射峰与标准卡片(JCPDS 34-0394)的（111）（200）（220）（311）晶面对应；因3'-唾液酸乳糖等电点为2.6（pH=7.4时带负电），CeOSL的zeta电位在pH=7.4时为-16.52 mV，pH=3.0时为-9.54 mV（图1e）。X射线光电子能谱（图1f）显示CeOSL的氮元素特征峰显著强于2 nm氧化铈，证实3'-唾液酸乳糖修饰成功；傅里叶变换红外光谱（图1g）中，CeOSL在470 cm⁻¹处有铈-氧-铈键特征峰，3200 cm⁻¹和986 cm⁻¹处分别有羟基、碳氮键特征峰，与 3'-唾液酸乳糖的光谱特征一致；紫外-可见吸收光谱显示其在290 nm处有氧化铈特征吸收峰，且该特征峰在pH=1.0~7.4的磷酸盐缓冲液中保持稳定（图1h）。
图1.发现队列与验证队列的基线临床特征
02.CeOSL的pH可编程催化特性
本研究以2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）(ABTS)为探针，在pH=1.0~7.4（模拟胃液与生理环境）的磷酸盐缓冲液中探究pH对CeOSL催化性能的影响，结果显示随pH从7.4降至1.0，734 nm处特征吸收峰强度逐渐增强，表明其活性氧产生能力具有pH依赖性（图2a-b）；以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)为显色剂开展实验，pH>2.0时活性氧将其氧化为蓝色电荷转移复合物，pH≤2.0时被进一步氧化为黄色二亚胺产物（图2c），pH=7.4时溶液无色且无明显吸收峰（图2d），证实酸性条件下CeOSL可催化产生活性氧且产量随pH降低而增加。为明确活性氧种类，用抗坏血酸、二甲基亚砜、超氧化物歧化酶、叠氮化钠分别清除不同活性氧，在pH=4.0时抗坏血酸显著抑制其催化活性（图2e），二甲基亚砜、叠氮化钠对催化活性无影响，超氧化物歧化酶几乎完全抑制氧化反应，证实超氧阴离子自由基是其发挥作用的关键活性物质；X射线光电子能谱分析（图2f）显示，在pH=4.0、1.0条件下催化反应后，CeOSL表面三价铈比例从31.72%分别降至28.74%、26.12%。在生理pH=7.4条件下，CeOSL对超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢三种代表性活性氧的清除能力均具有浓度依赖性（图2g-i）。
图2.CeOSL的智能响应特性
03.幽门螺杆菌的体外根除实验
在不同pH模拟胃液中，以50 μg/mL CeOSL作用幽门螺杆菌20分钟，琼脂平板菌落计数结果显示（图3a-b）：随pH降低菌落数显著减少，pH=7.4时细菌存活率100%（CeOSL类氧化酶活性受抑），pH=5.0~3.0时存活率从45.16%降至0.002%，空腹模拟胃液(pH=1.6)中无存活菌落，证实其可在强酸性环境下产超氧阴离子自由基，通过破坏细菌细胞膜实现强效杀菌。扫描电子显微镜观察（图3c），未加入CeOSL时，幽门螺杆菌在pH=5.0（胃黏液层）、pH=1.6（空腹胃液）的两种模拟胃液中，菌体形态均完整无破损，加入CeOSL后细菌细胞完整性遭到破坏；模拟肠液(pH=7.2)中，CeOSL处理含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的溶液未出现颜色与光谱变化（图3d，类氧化酶活性受抑），且对粪肠球菌、大肠杆菌无显著抗菌作用（图3e-f），表明CeOSL可在酸性环境中激活类氧化酶活性，实现对幽门螺杆菌的靶向根除，且不损伤肠道菌群。
图3.CeOSL体外抗幽门螺杆菌活性测试
04.幽门螺杆菌感染的体内治疗实验
为探究CeOSL的体内生物安全性与抗幽门螺杆菌疗效，对健康BALB/c小鼠灌胃实验显示，每日灌胃2 nm氧化铈或CeOSL连续4天、停药3天后，2 nm氧化铈组胃黏膜层破坏、上皮细胞空泡化（图3g），而CeOSL组胃组织形态正常（图3h），证实其安全性；构建幽门螺杆菌感染小鼠模型（图4a），4周龄小鼠每日灌胃2×10⁸CFU幽门螺杆菌连续4天、饲养2周后，胃组织DNA定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测阳性（图4b），将感染小鼠分三组灌胃磷酸盐缓冲液、OAC三联疗法（奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素）或CeOSL连续4天，停药3天后检测，CeOSL组胃内菌落数显著低于OAC组（图4b-d）。HE染色（图4e-f）显示，CeOSL组菌量极少、炎症浸润显著减轻；免疫荧光染色（图5a-d）与酶联免疫吸附实验（图5e-f）证实，CeOSL组促炎因子（白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α）表达低于OAC组，抗炎因子（白细胞介素-10）表达更高，可在酸性胃液中杀菌、在中性胃上皮细胞中清除活性氧调控炎症。
图4.针对幽门螺杆菌感染的体内治疗效果
图5.各组小鼠胃组织中 IL-1β、TNF-α 及 IL-10 的免疫荧光染色与 ELISA 检测结果
05.体内肠道菌群分析
采用16S核糖体RNA测序技术分析CeOSL对肠道菌群的影响。α多样性分析显示，CeOSL组的菌群丰富度和多样性显著高于OAC组，更接近健康组（图6a-b）。β多样性非度量多维尺度分析显示（图6c），健康组与CeOSL组的肠道菌群组成相似，且与OAC组存在显著差异。肠道内容物物种丰度热图显示（图6d），健康组和CeOSL组的物种丰度分布相近，而OAC组差异显著。OAC处理后，关键肠道菌群（Lactobacillus、Parabacteroides、Rikenellaceae等）的相对丰度显著低于健康组，而有害细菌（Desulfovibrionaceae、Escherichia、Klebsiella等）丰度显著升高。上述结果表明，CeOSL在中性 pH 条件下通过活性氧清除作用，不会破坏肠道菌群平衡，可避免抗生素类疗法引发的肠道菌群紊乱。
图6.肠道菌群分析
研究总结
本研究研发的胃肠环境智能响应型纳米酶CeOSL，能在不同生理部位选择性根除多重耐药幽门螺杆菌、调节胃上皮炎症并维持肠道菌群平衡：酸性胃液和黏液中激活类氧化酶活性、产超氧阴离子自由基靶向杀菌，中性胃上皮和肠道中类氧化酶活性受抑、转而清除活性氧以缓解炎症。体内实验证实，相较于临床一线OAC三联疗法，CeOSL根除幽门螺杆菌效果更强、减轻胃上皮炎症更有效，且不破坏肠道菌群稳态；其优势在于实现幽门螺杆菌高选择性清除，并借胃肠环境调控纳米酶活性转换同步完成杀菌与抗炎，为幽门螺杆菌相关胃部疾病治疗提供新思路，有望推动高效安全治疗方案研发。
