文章标题：Taurine can restrict MtdsRNA mediated pyroptosis by enhancing mitophagy in nucleus pulposus cells
发表期刊：Cell Communication and Signaling
影响因子：8.9
客户单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院
百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro、转录组测序
研究背景
腰痛主要由椎间盘退变(IVDD)引起，其与线粒体功能障碍密切相关。线粒体双链RNA(mtdsRNA)在线粒体受损时会释放至细胞质，激活RLR MAVS NLRP3通路，引发细胞焦亡及炎症。本研究发现，退变髓核组织中mtdsRNA水平升高，而细胞代谢物牛磺酸可抑制其释放。牛磺酸通过增强线粒体自噬维持线粒体稳态，从而阻断mtdsRNA介导的焦亡途径，提示mtdsRNA是治疗IVDD的潜在靶点，而牛磺酸可为IVDD的治疗提供潜在的干预策略。
研究概况
技术路线
研究结果
01.mtdsRNA在退变髓核组织中升高
为了研究mtdsRNA是否在临床退变样本中异常升高，首先对GSE245147测序数据进行了生物信息学分析。结果显示，退变髓核(NP)组织中差异表达基因包含dsRNA相关基因（如IFIT5、MX1、RIG-I、MDA5）显著上调，且Ⅰ型干扰素通路及RLR通路富集（图1a-b）。临床样本（按Pfirrmann分级）分析进一步证实，退变NP组织含水量下降、结构紊乱，同时mtdsRNA水平升高，其中ND5-L、ND6-L的升高尤为显著（图1c-e）。蛋白检测显示退变组织中PNPT1下调，RIG-I、MDA5、NLRP3表达上升，MAVS寡聚化增强，提示RLR-MAVS通路激活（图1f-g）。免疫荧光及免疫组化结果支持dsRNA与RLR蛋白共定位增加，且PNPT1下调与NLRP3升高相关（图1h-k）。综上，退变NP组织中mtdsRNA积累通过激活RLR信号通路，进而驱动炎症反应。
图1. mtdsRNA在退变髓核(NP)组织中表达升高
02.氧化应激促进mtdsRNA的渗漏
由于氧化应激可诱导mtdsRNA胞质逃逸，故在后续实验中使用脂多糖(LPS)刺激细胞，发现其可抑制髓核细胞(NPCs)增殖（图2a-b），破坏线粒体膜电位、增加细胞内ROS积累（图2c-f），并降低ATP水平（图2g），提示线粒体功能受损。同时，LPS下调PNPT1、上调BAX表达（图2h-l），导致mtdsRNA向胞质逃逸增加。通过qRT-PCR、链特异性PCR及RNA荧光原位杂交(FISH)证实，氧化应激下胞质mtdsRNA（特别是ND4-H/L）含量升高，且线粒体与dsRNA共定位增强（图2m-p）。结果表明，氧化应激通过损伤线粒体功能，促使mtdsRNA在胞质异常积累。
图2. 氧化应激促进mtdsRNA的渗漏
03.mtdsRNA触发RLR-MAVS-NLRP3轴并促进NPCs的焦亡
LPS诱导氧化应激激活RLR-MAVS通路并促进NPCs焦亡。为了探讨mtdsRNA与焦亡之间的关系，研究初步测定了焦亡指标。如图3a-f所示，LPS刺激可诱导NPCs发生焦亡，表现为NLRP3表达上调、CASP-1活性升高、GSDMD剪切活化、IL-1β释放增加及细胞器肿胀。同时，LPS上调RIG-I和MDA5表达，促进MAVS寡聚化，并增强RLR与MAVS的共定位（图3g-h）。RIP实验证实RIG-I和MDA5可直接结合mtdsRNA，免疫荧光实验进一步证实dsRNA与RIG-I、MDA5的共定位均增强。此外，LPS增强MAVS与NLRP3的相互作用及共定位（图3m-n）。敲低RIG-I、MDA5或MAVS均能减轻焦亡，其中MAVS敲低效果最显著，提示其在该通路中的核心作用（图3p-t）。综上，LPS刺激下mtdsRNA释放通过激活RLR-MAVS通路，进而促进NLRP3介导的焦亡。
图3. mtdsRNA触发RLR-MAVS-NLRP3轴并促进NPCs的焦亡
04.抑制mtdsRNA的渗漏可以减轻NPCs的焦亡
为了探索mtdsRNA与焦亡之间的关系，随后通过PNPT1的过表达、BAX的敲低和IMT1的利用来研究焦亡的程度。图4所示，通过过表达PNPT1、敲低BAX或使用IMT1抑制mtdsRNA生成，可有效缓解LPS诱导的线粒体功能障碍，降低胞质mtdsRNA水平，进而抑制RLR-MAVS-NLRP3通路激活。这些干预措施减弱了MAVS与NLRP3的相互作用，降低CASP-1活性和IL-1β释放，从而缓解NPCs焦亡。结果表明，抑制mtdsRNA渗漏可通过阻断RLR-MAVS-NLRP3轴减轻炎症性焦亡。
图4. 抑制mtdsRNA的渗漏可以减轻NPCs的焦亡
05.牛磺酸对于维持NPCs的线粒体功能至关重要
为了进一步了解mtdsRNA的上游调控机制，研究者采用非靶标代谢组学分析来研究代谢产物在LPS刺激下的变化。结果显示，LPS刺激导致NPCs代谢谱改变，其中牛磺酸代谢通路受影响显著（图5a-c）。LPS下调牛磺酸及其转运蛋白SLC6A6的表达，临床退变样本也证实牛磺酸含量降低且SLC6A6减少（图5d-g）。敲低SLC6A6可降低细胞内牛磺酸水平，诱导ROS积累、PNPT1下调及mtdsRNA释放，进而上调RLR表达并激活RLR-MAVS-NLRP3轴。相反，补充牛磺酸能恢复细胞内牛磺酸水平，减轻氧化应激，改善线粒体功能，抑制RLR-MAVS-NLRP3通路激活，并缓解细胞焦亡（图5h-p）。结果表明，牛磺酸缺乏通过促进mtdsRNA渗漏加剧炎症性损伤，而补充牛磺酸具有保护作用。
图5. 牛磺酸对于维持NPCs的线粒体功能至关重要
06.牛磺酸可以抑制mtdsRNA的渗漏
为了进一步探索mtdsRNA在牛磺酸保护作用中的重要性，在细胞被刺激前使用IMT1对其进行处理。研究发现，牛磺酸能恢复细胞活力（图6a），但该保护作用在使用IMT1抑制mtdsRNA后显著减弱。牛磺酸处理降低了胞内mtdsRNA水平，同时上调PNPT1、下调BAX表达，减少BAX与线粒体共定位（图6b-e）。图6f-k所示，即使在外源性poly(I:C)诱导mtdsRNA增加的情况下，牛磺酸仍能抑制其胞内积累，并缓解poly(I:C)介导的细胞内牛磺酸下调。RNA测序分析显示（图6i-m），牛磺酸可下调干扰素刺激基因、炎症及氧化应激相关基因的表达，同时上调ROS解毒及线粒体自噬相关基因。GSEA进一步证实牛磺酸抑制Ⅰ型干扰素通路及炎症反应，并增强抗氧化能力。综上，牛磺酸通过调节PNPT1/BAX平衡、抑制mtdsRNA释放，并激活保护性自噬通路，从而减轻氧化应激与炎症损伤。
图6. 牛磺酸可以抑制mtdsRNA的泄漏
07.牛磺酸可以通过增强线粒体自噬来抑制mtdsRNA-MAVS-NLRP3轴
为探究牛磺酸调控线粒体自噬的机制，研究使用自噬抑制剂3-MA进一步观察牛磺酸对线粒体自噬的影响。如图7a-d所示，3-MA可增加ROS、降低线粒体膜电位，逆转牛磺酸的保护作用。通过mRFP-GFP-LC3腺病毒示踪及WB检测发现，牛磺酸促进自噬体形成与成熟，并激活PINK1-Parkin通路，而3-MA抑制该过程。免疫荧光进一步证实牛磺酸增强PINK1与Parkin共定位，促进受损线粒体清除。此外，抑制线粒体自噬（3-MA处理）可逆转牛磺酸对PNPT1/BAX表达及线粒体稳态的调节作用，进而导致胞质mtdsRNA积累。对RLR-MAVS-NLRP3通路的分析表明，牛磺酸通过增强线粒体自噬抑制该轴激活，而3-MA则抵消此效应（图7e-k）。综上，牛磺酸通过激活PINK1-Parkin介导的线粒体自噬，清除受损线粒体、减少mtdsRNA泄漏，进而抑制RLR-MAVS-NLRP3炎症通路。
图7. 牛磺酸可以通过增强线粒体自噬来抑制mtdsRNA-MAVS-NLRP3轴
08.牛磺酸可通过抑制mtdsRNA-MAVS-NLRP3来缓解IVDD
为了建立LPS诱导的IVDD模型，向大鼠Co8/9椎间盘注射LPS，治疗组同时加入牛磺酸。一月后观察发现，牛磺酸可部分恢复LPS导致的椎间盘高度降低及MRI T2信号减弱，改善组织学结构，减少纤维化、维持髓核-纤维环边界及纤维环层状结构，改善髓核细胞聚集现象（图8a-d）。免疫组化及免疫荧光结果显示，LPS降低PNPT1、升高BAX及NLRP3表达，并增强RLR与dsRNA共定位；而牛磺酸能逆转这些变化，恢复PNPT1表达，降低BAX、NLRP3及dsRNA水平，抑制炎症通路激活（图8e-h）。综上，牛磺酸在大鼠IVDD模型中具有保护作用，能减轻椎间盘退变及炎症损伤。
图8. 牛磺酸可通过抑制大鼠mtdsRNA-MAVS-NLRP3来缓解IVDD
研究总结
本研究揭示了mtdsRNA在IVDD中的致病机制及牛磺酸的调控作用。研究发现，退变NPCs中线粒体功能障碍导致mtdsRNA异常释放至胞质，激活RIG-I/MDA5受体并诱导MAVS寡聚化，进而招募NLRP3炎性小体，触发焦亡，进而引发炎症反应。代谢组学分析显示退变NPCs存在牛磺酸缺乏，其通过促进线粒体功能障碍加剧mtdsRNA积累。补充牛磺酸可增强线粒体自噬，抑制mtdsRNA释放，从而减轻NLRP3介导的焦亡（图9）。研究进一步探讨了mtdsRNA的上游调控：已有研究表明氧化应激下调PNPT1表达，促进mtdsRNA释放；本研究发现牛磺酸缺乏同样可下调PNPT1并触发mtdsRNA泄漏，提示牛磺酸在维持线粒体健康中的关键作用。实验中证实mtdsRNA可同时与RIG-I和MDA5结合，其下游相互作用可能因应激条件而异。总之，mtdsRNA是IVDD进展的关键介质，靶向mtdsRNA或通过牛磺酸代谢恢复线粒体核酸稳态，可能为IVDD及下腰痛(LBP)的治疗提供新策略。
图9. 牛磺酸可以通过增强线粒体自噬来限制mtdsRNA介导的焦亡
