英文标题：Exogenous fatty acid renders the improved salt tolerance in Zygosaccharomyces rouxii by altering lipid metabolism
发表期刊：LWT
影响因子：6.6
客户单位：四川大学
百趣提供服务：非靶标代谢流
研究背景
鲁氏接合酵母(Z. rouxii)长期以来一直用于传统发酵食品中，与食品的高品质和特殊风味密切相关。此前研究表明，补充外源脂肪酸可以进一步增强Z. rouxii 的耐盐性。确切的机制尚未可知，可能是外源性脂肪酸调节脂质代谢，改变细胞膜中脂质的组成。故而，本研究旨在通过代谢流分析和脂质组学探索相关机制。
研究概览
研究结论
01.Z.rouxii 吸收同位素标记的外源脂肪酸
代谢流分析结果显示360种代谢物带有同位素标记，其中76种代谢物参与KEGG通路。富集分析结果可见（图1A），同位素在代谢途径中广泛分布，特别是在脂质代谢相关途径。KEGG map01100中可见（图1B）同位素标记的代谢物分布在六个代谢模块。大多数代谢物参与脂质代谢，如磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)和鞘氨醇(sphingosine, Sph)代谢、脂肪酸代谢、甾醇生物合成。除此之外，聚糖代谢、萜类化合物和聚酮类化合物的生物合成以及氨基酸代谢中亦可见同位素标记代谢物。在盐胁迫下，这些代谢物之间的代谢通量普遍增加，具体体现在甲酰辅酶A、(3S)-柠檬酰辅酶A、脱磷辅酶A，NAD+、鞘氨醇和麦角甾醇等代谢物上。以上结果证实，进入细胞的外源脂肪酸参与脂质合成和代谢，代谢物间的代谢通量增加。
图1. 盐胁迫下Z. rouxii 中参与代谢的标记代谢物的同位素比值和代谢通量分析
02.外源脂肪酸调控盐胁迫下Z. rouxii 的脂肪酰代谢通量
在盐胁迫下Z. rouxii细胞内共检测到16种同位素标记的脂肪酰基（图2A）：除了外源脂肪酸C12:0，细胞内还检测到被标记的C13:0、C14:0、C16:0等长链脂肪酸，这表明外源脂肪酸被细胞吸收后，作为前体参与了脂肪酸的碳链延长过程。此外，C14:1、C16:1、C18:1、C18:2和C18:3的标记检出提示外源脂肪酸可以调控不饱和脂肪酸的合成。与0 g/L NaCl相比，120 g/L NaCl胁迫下脂肪酰基的同位素比值增加，反映出Z. rouxii 在盐胁迫下对外源脂肪酸的吸收能力增强（图2B）。
图2. 盐胁迫下Z. rouxii 中同位素标记的脂肪酰基的同位素比值和代谢通量的变化分析
03.盐胁迫和外源脂肪酸处理下Z. rouxii 的脂质组学分析
研究人员采用PCA模型评估了盐胁迫和补充外源脂肪酸后Z. rouxii 中脂质谱的变化。结果显示，不同对比间组别分离度良好（图3A-D）。火山图可见120 g/L NaCl vs 0 g/L NaCl对比下差异脂质数量最多，且在120 g/L NaCl胁迫下，多数脂质含量增加。此外，添加了外源脂肪酸C12:0后，些许脂质的含量发生变化（图3E-H）。韦恩图可见四个对比策略下的差异脂质数量（图3I），共有的4个差异脂质是PC(14:0/18:0)、PC(14:0/16:0)、PI(16:0/16:1)和PS(16:0/22:5)。
盐胁迫下，溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)占比降低，磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidyl ethanolamine, LPE)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)和磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)比例显著增加。补充了外源性FA 12:0后，FA和二酰基甘油(diacylglycerol, DAG)的比例有所提高（表1）。以上结果表明，盐胁迫和外源脂肪酸处理下，Z. rouxii 细胞内脂质含量发生了变化。
图3. 盐胁迫和C12:0添加下Z. rouxii 的脂质组学分析
表1. 不同处理条件下脂质类别的相对含量变化
04.盐胁迫和外源脂肪酸处理下差异脂质的分类分析
为了探究盐胁迫和外源脂肪酸添加对Z. rouxii 脂质代谢的影响，研究人员分析了差异脂质的丰度变化（图4）。变化最大的脂质是PC、PE和PI。在120 g/L的NaCl胁迫下，多数脂质的含量普遍增加，如DAG、FA、LPC、LPE、PC、PE、PI、PS、磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol, PG)。补充外源脂肪酸后，部分三酰甘油(triacylglycerol, TAG)丰度增加。
随后，分析了盐胁迫下Z. rouxii 细胞中前10种差异脂质的不饱和度变化（图5A），发现PA、PS、PE、PC和PG具有较高的不饱和度。在120 g/L NaCl胁迫下，总脂质不饱和度显著增加，当补充了FA 12:0，脂质不饱和度降低。添加脂肪酸后PI/PS值略有增加，而在盐胁迫下这种变化不明显（图5B）。盐胁迫下，PC/PE值下降，而添加脂肪酸后比值变化不显著（图5C）。
图4. 盐胁迫下Z. rouxii 差异脂质丰度的热图
图5. 差异脂质不饱和指数和磷脂比值的变化
05.代谢流和脂质组变化的联合分析
为了进一步揭示外源性脂肪酸进入细胞后对脂质合成和代谢的调控，研究人员对代谢通量和脂质组变化进行了联合分析。外源脂肪酸C12:0首先进入细胞参与膜脂肪酸的合成（图6A）。然后，脂肪酸生成乙酰辅酶A，参与其他脂质的合成，如DAG、TAG、PS、PE、PC等。最后，游离脂肪酸(free fatty acids, FFA)通过β氧化产生ATP，为酵母细胞提供能量。所有这些脂质的代谢通量均增加（图6B），其中DAG和PS的通量提高了2倍以上。脂质组学结果显示，盐胁迫下脂质FA、PE和PC丰度提高了1.5倍以上，进一步证实了代谢通量分析的结果。此外，代谢通量和脂质组差异脂肪酸的皮尔森相关性分析（图6C）表明，除了FA 13:0的代谢通量与FA 18:1、FA 22:0的代谢通量以及FA 13:0的代谢通量与FA 16:1、FA 18:1的脂质组丰度呈负相关外，余主要呈正相关。特别是脂质组学中的差异脂肪酸之间表现出显著的正相关关系。
图6. 盐胁迫下补充外源脂肪酸影响Z. rouxii 脂质代谢通量和脂质组变化的简化示意图
研究总结
本研究首次采用同位素标记代谢流分析和拟靶向脂质组学联合，以探索外源性脂肪酸对脂质合成和耐盐性的影响。结果表明，¹³C标记的脂肪酸在Z. rouxii 细胞中可以被检测到，进一步证明了Z. rouxii 能吸收外源脂肪酸，且在盐胁迫下吸收率更高。此外，还检测到了同位素标记的其他脂肪酸或脂质，在盐胁迫下多数代谢物的代谢通量增加，提示外源脂肪酸主要调控细胞的脂质合成。134种脂质在盐胁迫期间表现出不同的丰度。大多数脂质丰度增加，总脂质不饱和度提高。Z. rouxii 增强了整体脂质的合成，提升了代谢通量和脂质含量，进而抵抗盐胁迫。总的来说，这些发现为食品酵母中脂质和脂质衍生化学品的绿色生物制造生产提供了技术支持。
