文章标题：Anthocyanin improves kidney function in diabetic kidney disease by regulating amino acid metabolism

发表期刊：Journal of Translational Medicine

影响因子：8.44

作者单位：中山大学附属医院

百趣提供服务：Label free定量蛋白质组学、非靶向代谢组学

研究背景

目前超过40%的糖尿病(Diabetes mellitus, DM)患者中会存在糖尿病肾病(Diabetic kidney disease, DKD)，DKD是慢性肾脏疾病最重要的病因之一。花青素(AnthoCyanins, ANT)是存在于各种食物中的多酚类化合物，在改善高血糖和胰岛素敏感性方面发挥着重要作用。然而，目前ANT在DKD中的作用还知之甚少。本研究对DKD小鼠的肾脏和血清样本进行了Label free定量蛋白质组学和非靶向代谢组学（百趣生物提供）的综合分析，旨在评估ANT(cyanidin-3-O-glucoside [C3G])对DKD患者肾功能的影响，以及ANT的抗DKD作用是否与代谢途径有关。

技术路线

研究结果

1.ANT降低DKD小鼠体重和血糖水平并改善肾小球病变和纤维化

本研究构建了3组小鼠实验模型，分别为：CT组（对照组：12只db/m小鼠），DKD组（糖尿病肾病组：11只db/db小鼠）和ANT组（花青素处理组：11只db/db小鼠），然后作者研究了ANT对小鼠生化参数和肾组织病理学的影响。结果显示，在第8~20周，DKD组小鼠的体重显著高于CT小鼠，而在第15周后，ANT组小鼠体重显著高于DKD组，在第8周后，DKD组小鼠空腹血糖水平明显高于CT组，12周后，ANT可改善DKD组升高的空腹血糖水平。因此认为ANT可以降低DKD的体重和空腹血糖水平。

肾切片H&E染色(Hematoxylin-eosin staining)显示DKD组小鼠肾小球肿大，肾间质水肿，炎症细胞充盈。与对照组相比，DKD组肾小球周长和面积增加。而ANT处理后，肾小球、肾间质肿大、炎症细胞充盈的情况得到缓解，肾小球周长减少。PAS染色(Periodic acid-schiff stain)显示DKD组肾小球细胞增多，系膜扩张。ANT治疗后肾小球病变明显缓解。肾组织马松染色(Masson stain)显示DKD组肾小球和肾间质纤维化。然而，在ANT处理下，纤维化得到了改善。表明，ANT可以缓解DKD小鼠的肾小球病变和纤维化（图1）。

图1. 三组小鼠的生化参数和肾组织病理学特征

2.ANT对db/db小鼠蛋白表达谱的影响

基于Label free定量蛋白质组学的方法，作者对CT组（6只小鼠），DKD组（6只小鼠）和ANT组（5只小鼠）的肾脏组织和血清样本分别进行了检测。

在组织样本中，一共鉴定出6355个蛋白质。其中，DKDvsCT组和ANTvsDKD组分别鉴定出712和3642个差异表达蛋白(Differentially expressed proteins, DEPs)。为了确定ANT在肾脏中调控的靶蛋白，作者首先对CT、DKD和ANT组进行了STEM趋势分析，并在样例1、5、6、9、10和14中鉴定出了趋势蛋白。ANT组中186个肾趋势蛋白在DKDvsCT组和ANTvsDKD组中显著差异表达，而ANT治疗后可被抵消。在这些蛋白中，Mbl2(Mannose-binding protein C)、Cst3(cystatin C)和Vav1(Proto-oncogene vav)表达水平的升高可能会增加糖尿病肾病的风险。通过Metascape网站分析，ANT组肾脏趋势蛋白主要富集在代谢途径中，包括羧酸、α-氨基酸、含碱基小分子、甘氨酸、天门冬氨酸家族氨基酸、细胞修饰氨基酸和β-丙氨酸代谢（见图2）。

图2. ANT对小鼠肾脏蛋白表达谱的影响

在血清样本中，一共检测到1673种蛋白质，其中在DKDvsCT组和ANTvsDKD组分别鉴定出260和594个DEPs。作者观察到ANT组中36个血清趋势蛋白在DKDvsCT组和ANTvsDKD组之间有显著差异表达，但在ANT治疗后可以被抵消。在这些蛋白中，Plvap(Plasmalemma vesicle-associated protein)、Itgb2(Integrin beta-2)和Rbp4(Retinol-binding protein 4)可能与糖尿病肾小球病变的严重程度增加有关。通过Metascape网站分析，ANT血清趋势蛋白在补体和凝血级联、血浆脂蛋白颗粒组织、细胞外基质组织、细胞-底物粘附调节、白细胞迁移调节和造血等方面均显著富集（见图3）。

图3. ANT对小鼠血清蛋白表达谱的影响通过DKD组和CT组的比较，发现血清和肾脏样本中共同检测到31个DEPs，包括已知的糖尿病相关蛋白，如Serpina3k、Lpl、C1qb、Lgals3、Ctsd、Pdgfra、Apoc3、Apoc1、Lifr和Igfbp2，而在ANT组和DKD组血清和肾脏样本中均检测到178个DEPs。三组血清和肾脏中同时检测到5个相同的DEPs(Capg、Pxdn、Mup20、Myh1和C8g)。相关性分析显示，CT组、DKD组和ANT组中循环和肾组织蛋白之间无显著相关性，提示ANT对肾蛋白和循环蛋白的治疗作用是相互独立的。

3.Db/db小鼠肾脏和血清代谢组学特征研究

作者比较了CT组和DKD组的肾脏和血清代谢组学。在肾脏和血清中，OPLS-DA模型显示CT组和DKD组的代谢物分布有显著差异。最终在CT组、DKD组肾脏和血清中分别鉴定出了228和171个DEMs。KEGG通路富集分析发现肾脏和血清中的DEMs分别有34条和23条通路显著富集，主要涉及5类代谢异常，包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂类代谢、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢。进一步，对两组之间的通路活性进行了GSVA分析。结果发现，在肾脏中，花生四烯酸代谢被列为表达升高最明显的途径，而脂肪酸生物合成活性下降。此外，许多氨基酸代谢通路活性表达显著降低，包括组氨酸代谢、赖氨酸降解、精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢和酪氨酸代谢。辅助因子和维生素代谢途径表达也显著降低，包括烟酸盐和烟酰胺代谢、维生素B6代谢、泛酸盐和辅酶a生物合成。碳水化合物代谢途径，包括肌醇磷酸盐和β-丙氨酸代谢表达显著降低。血清中赖氨酸降解途径表达升高，DKD组肾脏和血清中其他氨基酸代谢途径活性下降。强调了DKD发病机制中不同生物实体中代谢物的不同改变（见图4）。

图4. DKD患者肾脏和血清的代谢特征

4.ANT对db/db小鼠代谢表达谱的影响

作者在ANTvsDKD组肾脏和血清中最终分别鉴定出311个和282个DEMs。为了确定肾脏和血清中ANT调控的靶向代谢物，本研究对CT、DKD和ANT组代谢物进行了STEM分析，并将样例1、5、6、9、10和14中的代谢物确定为趋势代谢物。进一步分别对肾脏和血清中的46和47趋势代谢物进行层次聚类分析。分别对肾脏中DKDvsCT、ANTvsDKD组以及趋势代谢物中的228、311和46个DEMs进行了分类，观察到“有机酸及其衍生物”类丰富，“苯”类稀少。此外，分别对血清中171、282和47个DEMs进行了分类。发现在趋势代谢物中，“有机杂环化合物”类丰富，“核苷类、核苷酸类及类似物”和“苯”类很少。

图5. ANT对小鼠肾脏和血清中代谢产物表达谱的影响

进一步对肝脏中的46种趋势代谢物进行了GSVA分析，发现DKDvsCT组和ANTvsDKD组中，牛磺酸和次牛磺酸代谢途径均有显著改变，该通路在DKDvsCT组间表达下调，在ANTvsDKD间表达上调。此外，对血清中47种趋势代谢物进行了GSVA分析。DKDvsCT组和ANTvsDKD组中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺生物合成途径显著改变。两种通路在DKDvsCT之间表达上调，在ANT组和DKD组之间表达下调。此外，DKDvsCT组和ANTvsDKD组中色氨酸和酪氨酸代谢途径也显著改变。两种通路在DKDvsCT之间下调，在ANTvsDKD组之间上调。作者观察到ANT处理后色氨酸代谢途径中，血清中l-色氨酸和L-kynurenine下调，5-甲氧基吲哚乙酸和吲哚-3-乙醛上调。在酪氨酸代谢方面，ANT处理后马来酸和富马酸下调，吲哚5,6-醌上调（见图6）。

图6. 肾脏和血清中ANT趋势代谢产物KEGG通路及被ANT改变的代谢通路的GSVA分析

结论

综上所述，该研究揭示了ANT在DKD中的多重改善作用，包括抑制空腹血糖、改善肾功能和肾脏组织病理学改变。通过采用Label free非标记定量蛋白质组学和非靶向代谢组学分析，探讨了ANT减轻DKD肾脏损害的潜在机制。蛋白质组学和代谢组学分析表明，ANT有效地改变了db/db小鼠肾脏和血清的蛋白质组和代谢表型。检测到了先前研究中报道的许多DKD相关血清和肾脏蛋白，验证了本次的方法，同时观察到ANT肾脏趋势蛋白和代谢产物在氨基酸代谢中富集，主要在牛磺酸和低牛磺酸代谢中；ANT血清趋势蛋白在补体和凝血级联中富集，ANT血清的趋势代谢产物在色氨酸和酪氨酸代谢中富集。通过本文的研究表明食物中的ANT可能是一种潜在的氨基酸代谢调节剂，可以改善肾功能和肾脏形态。揭示了饮食中使用ANT预防和治疗DKD的潜在临床效果。