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分类:
阿趣动态
发布时间:
2019/08/27 11:15
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热烈庆贺中山大学关于金属抗癌化疗药物研究的3篇文章顺利发表在:
 
Chemistry a European Journal (IF=5.16)
文章研究方向:具有平面配体的抗癌环化铱(III)复合物对线粒体DNA损伤和代谢紊乱的影响
 
Journal of Medicinal Chemistry (IF=6.045) 
文章研究方向:抗癌铱(III)-阿司匹林偶联物用于增强代谢免疫调节和线粒体寿命的研究
 
Applied materials & interfaces (IF=8.456) 
文章研究方向:线粒体积累铼(I)三羰基复合物通过诱导不可逆氧化应激和谷胱甘肽代谢紊乱导致细胞死亡的研究
 
BIOTREE很荣幸能够为三项研究提供代谢组学服务。感谢中山大学的信任。
 
今天,Reeves就为大家深度解读其中一篇文章。对三篇文章原文感兴趣的小伙伴可以自行阅读,文章链接将在文末列出。
 
线粒体积累铼(I)三羰基复合物通过诱导不可逆氧化应激和谷胱甘肽代谢紊乱导致细胞死亡的研究 (IF=8.456)
 
研究背景
 
癌细胞能够维持强大的增殖能力,其线粒体的生物合成和能量生成与正常细胞相比均上调。该变化是导致活性氧 (ROS) 升高的原因。越来越多的研究证明,靶向线粒体和干扰氧化还原稳态是一种潜在有效的化疗方法。
 
自顺铂 (CDDP) 的发现以来,金属药物在化疗中发挥了重要作用。但基于铂的药物可以诱发不可逆的副作用和耐药性。铼复合物因其有利于化疗的内在特性而引起了人们的关注。然而,在大多数情况下铼复合物的抗癌机制尚不清楚。
 
在本研究中,合成了两个双核铼 (I) 三羰基复合物 (ReN和ReS)。ReN和ReS可与谷胱甘肽 (GSH) 反应,且它们对癌细胞系表现出良好的体外抗癌活性。
 
此外,它们可以靶向线粒体引起氧化应激并干扰GSH代谢、诱导坏死凋亡和半胱氨酸天冬氨酸酶 (caspase) 依赖的细胞凋亡,还可以抑制携带癌异种移植物的裸鼠中肿瘤的生长。该研究显示了Re (I) 复合物作为化学治疗剂通过线粒体 - 细胞氧化还原策略杀死癌细胞的潜力。
 
结果
 
2.1 双核铼 (I) 三羰基复合物的合成与表征
 
首先按照Scheme S1的流程进行双核铼 (I) 三羰基复合物的合成,得到的ReN和ReS通过ESI−MS、1H NMR、13C NMR以及元素分析进行表征,并使用单晶X射线衍射 (XRD) 的方法呈现ReN结构特征 (Figure 1B)。
 
Scheme S1.
双核Re (I) 配合物的一般合成方法
 
Figure 1.
(A) ReN和ReS的化学结构;(B) ReN的X射线晶体结构
 
2.2 ReN和ReS的光物理性质
 
大多数Re(I)三羰基配合物磷光持续时间长,有较大的斯托克斯位移(Stokes shifts)和较高的量子产率,这对于细胞内感测和生物成像是有利的。ReN和ReS在260nm-320nm下有较强的吸收谱带,而在320-450nm吸收谱带较弱 (Figure 2A),在405nm激发时,它们会在CH2Cl2中呈现出由黄色到红色的荧光发射 (Figure 2B),此外,ReS在肿瘤内注射后具有更好的体内荧光发射能力 (Figure 2C)。
 
Figure 2.
(A) ReN和ReS紫外线吸收光谱;(B) 10uM ReN和ReS下归一化荧光发射光谱,激发波长为405 nm;(C) ReN和ReS在体内和体外的荧光发射
 
2.3 ReN和ReS可与谷胱甘肽 (GSH) 反应
 
GSH是细胞中最丰富的还原剂,其所携带的偶氮键和二硫键已被用于设计前药和缺氧探针。加入GSH后,ReN和ReS与其发生的氧化还原反应可利用光物理学行为进行检测,在加入GSH (20uM) 后ReN和ReS在20min内吸收波谱的变化情况如Figure 3A 所示,两种Re配合物的半衰期均小于1分钟,表明该反应过程迅速。ReN和ReS荧光发射强度增加 (Figure 3B),荧光寿命增强 (Figure 3C)。
 
Figure 3.
(A) 与GSH (20μM) 反应后ReN和ReS(20μM) 的吸收光谱;(B) 具有或不具有GSH (1mM) 的H2O中的ReN和ReS (20μM) 的荧光发射光谱和 (C) 荧光寿命,激发波长为405nm
 
2.4 ReN和ReS的细胞毒性
 
在A549 (人肺腺癌上皮细胞)、A549R (顺铂耐药A549)、HeLa (人宫颈癌)、HepG2 (人肝细胞肝癌)、MCF-7 (人乳腺癌)、U2SO (人骨肉瘤)、PC3 (人前列腺癌) 和 LO2 (人正常肝脏) 细胞中评估ReN和ReS的细胞毒性 (Table 1)。ReS和ReN的IC50值除了在PC3和HepG2中均低于CDDP (顺铂),说明ReS和ReN具有更高的抗癌活性。此外,ReN和ReS还可以抑制体外集落的形成 (Figure 4)。
Table 1.
 
Figure 4.
海拉细胞集落形成抑制
 
2.5 ReN和ReS诱导线粒体功能障碍
 
由于ReN和ReS可以发出磷光,因此很容易跟踪它们的细胞分布。Figure 5A表明ReN和ReS的荧光能很大程度上与MitoTracker深红色 (MTDR) 的荧光叠加 (具有较高的Pearson’s共定位系数)。ICP-MS检测也表明ReN和ReS在线粒体中显著积累 (Figure 5B)。经ReN和ReS处理2小时后,管状线粒体肿胀成球状 (Figure 5C)。另外,ReN和ReS也会导致线粒体去极化的细胞百分比增多及线粒体膜电位 (MMP) 也呈剂量依赖性下降。这些结果证实了ReN和ReS能够靶向并去极化线粒体。
 
使用ReN和ReS处理6h后,线粒体DNA (mtDNA) 拷贝数显著降低 (Figure 5D),且对海拉细胞的线粒体呼吸分析表明ReN和ReS处理后细胞的氧消耗率 (OCR) 随剂量增多而下降(Figure 5E)。qPCR结果表明在处理后mtDNA编码的13基因个表达量下调,且这些基因均是氧化磷酸化系统关键的亚基 (Figure 5F)。这些结果说明ReN和ReS能够损害线粒体生物能状态和细胞呼吸。
 
Figure 5.
(A) 在HeLa细胞中ReN和ReS与MTDR的代表性共定位图;(B) 通过ICP-MS测量的线粒体和胞质溶胶中Re元素的含量, 用ReN和ReS以10μM处理细胞1小时;(C) HeLa细胞中的线粒体形态学变化;(D) HeLa细胞中mtDNA的相对拷贝数;(E) HeLa细胞的线粒体呼吸OCR谱;(F) ReN和ReS对线粒体基因转录的影响
 
2.6 ReN和ReS诱导细胞氧化压力
 
过量的活性氧 (ROS) 可以加速肿瘤的发生,改变代谢途径,而致命水平的ROS可以触发细胞死亡,可以通过DCFH-DA染色检测ReN和ReS对初级ROS的影响。ReN和ReS在孵育2 h后可分别诱导ROS增加 (Figure 6A),超氧化物的数量在处理后也增加 (Figure 6B)。初级ROS过多会导致次级ROS (如脂氧化物) 增加 (可通过丙二醛MDA含量反应) (Figure 6C), ReN和ReS处理12小时后SOD的催化能力降低 (Figure 6D),这可以解释超氧化物增加的结果。此外,处理组细胞中的CAT活性没有显著改变 (Figure 6E)。
 
Figure 6.
(A) 用ReN或ReS处理2小时的HeLa细胞中ROS升高;(B) 由ReN和ReS诱导的HeLa细胞中的超氧化物;(C) HeLa细胞中的脂质氧化水平;(D) HeLa细胞中的SOD活性;(E) HeLa细胞中的CAT活性;(F) Re复合物诱导的不可逆氧化应激过程
 
2.7 ReN和ReS可扰动GSH代谢
 
使用基于GC−TOF−MS代谢组学手段分析潜在的药物相关代谢产物和途径。PCA模型 (Figure 7A)和OPLS-DA模型 (Figure 7B)中ReN和ReS处理组均与对照组有较好的分离,且大部分差异代谢物在处理组中均下调,说明ReN和ReS抗癌机制可能类似。通路富集分析发现Re复合物显著影响氨基酸相关的通路以及谷胱甘肽代谢 (Figure 7C),且一些必需、非必需氨基酸、糖酵解及TCA循环中某些物质 (反应能量生成水平) 均下调 (Figure 7D),oxoproline是下调最显著一种代谢物,其是γ-谷氨酰环转移酶催化GSH的产物,且二者浓度均下调 (Figure 7D)。
 
Figure 7.
(A) PCA得分图;(B) OPLS-DA得分图;(C) 用ReN处理的HeLa细胞的KEGG途径分析的气泡图;(D) 重要的差异代谢物的相对含量
 
如Figure 8A所示,用ReN和ReS处理后GSH和GSSG的含量下调,GSH / GSSG的比例也下降。GSSG的NADPH依赖性还原可以通过谷胱甘肽还原酶 (GR) 催化,发现ReN和ReS处理后NADPH和NADP+水平增加,GR酶活性降低 (Figure 8C,D)。
 
Figure 8.
(A) HeLa细胞中GSH和GSSG的浓度;(B) HeLa细胞中NADP +和NADPH的含量;(C) 用8μM的ReN和ReS处理12小时后HeLa细胞中的GPx活性;(D) 用8μM ReN和ReS处理12小时后HeLa细胞中GR活性
 
2.8 ReN和ReS诱导细胞凋亡和坏死
 
如Figure 9A所示,Re复合物的处理导致凋亡和坏死阶段以及无活力阶段中细胞百分比随剂量增加而增加。细胞内Ca2+过多与细胞死亡相关,Ca2+可通过Fluo-4AM染色检测,Fluo-4AM染色发现Fluo-4AM的荧光发射强度在处理组细胞中随剂量增加而增强 (Figure 9B),且与未处理的细胞相比,caspase-3/7的活性随药物剂量的增加而增加 (Figure 9C)。另外,使用坏死性凋亡抑制剂Nec-1和泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk进一步验证细胞死亡模式,发现用nec1预处理后,细胞活力增加 (Figure 9D)。此外,还可以通过nec1和z-VAD-fmk的联合预处理进一步提高细胞的存活率 (Figure 9E)。
 
Figure 9.
(A) 通过膜联蛋白V / PI染色流式细胞术检测细胞凋亡;(B) 与ReN和ReS孵育6小时后HeLa细胞中Ca2+水平;(C) HeLa细胞中caspase-3/7的活性;(D) 用坏死性凋亡抑制剂预处理后的细胞活力;(E) 用坏死性凋亡抑制剂和凋亡抑制剂预处理后的细胞活力
 
2.9 ReN和ReS抑制异种移植体在体内的生长
 
通过瘤内注射的方式在将ReN和ReS注射到模型小鼠内,并观察19天时肿瘤大小情况 (Figure 10A),发现二者均能抑制肿瘤生长,但其效果不如CDDP好 (Figure 10B),通过体重 (Figure 10C)、存活率 (Figure 10D)、苏木精和伊红(H&E) 染色 (Figure 10E) 对不同Re复合物的副作用进行评价,从染色结果可以看出不同器官中病理状态变化不显著,说明ReN和ReS不会引起严重的副作用。
 
Figure 10.
(A) 实验后第19天的肿瘤;(B) 用PET稀释剂处理后的肿瘤体积;(C) 体重和 (D) 裸鼠的存活率;(E) 器官的H&E染色
 
结论
 
在本研究中,合成和表征了两个双核Re(I)三羰基配合物ReN和ReS。ReN和ReS主要在线粒体中积累,引起氧化应激和线粒体功能障碍,并减缓生物能量。此外,GSH代谢和氧化还原稳态受到影响氧化还原相关酶的物质的干扰,ReN和ReS同时诱导坏死凋亡和半胱天冬酶依赖性细胞凋亡,并抑制体内肿瘤生长。
 
总之,当前的研究表明,铼复合物可以通过不可逆的氧化应激和细胞氧化还原失衡发挥其抗癌作用。这项研究为我们设计新的Re复合物提供了灵感,以优化氧化还原调节的动力学,以及在不久的将来的抗癌能力。
 
欢迎下载以下三篇文章阅读原文:
(下载地址:https://pan.baidu.com/s/1crlVLGSd3jstoBlQjFtGBg)
 
中山大学: Wu XW, Zheng Y, Wang FX, et al. Anticancer IrIII-Aspirin Conjugates for Enhanced Metabolic Immuno-Modulation and Mitochondrial Lifetime Imaging. Chemistry 2019 May 17;25(28). (IF= 5.16)
 
中山大学: Cao JJ, Zheng Y, Wu XW, et al. Anticancer Cyclometalated Iridium(III) Complexes with Planar Ligands: Mitochondrial DNA Damage and Metabolism Disturbance. Journal of  Medicinal Chemistry 2019 Apr 11;62(7). (IF= 6.054)
 
中山大学: Wang FX, Liang JH, Zhang H, et al. Mitochondria-Accumulating Rhenium(I) Tricarbonyl Complexes Induce Cell Death via Irreversible Oxidative Stress and Glutathione Metabolism Disturbance. ACS Applied Materials & Interfaces 2019 Apr 10;11(14). (IF= 8.456)
 
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