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文献分享 | 多组学联合分析阐述玉米自噬的影响

分类:
阿趣动态
发布时间:
2019/01/31 15:58
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细胞自噬不知大家是否了解?2016年,日本科学家大隅良典(Yoshinori Ohsumi)凭借“细胞自噬机制方面的发现”获得了诺贝尔生理学与医学奖!
 
自噬,通俗来说就是自己吃自己。细胞自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。细胞自噬对于回收细胞成分是必不可少的,在饥饿应答时尤其重要。
 
代谢组学
 
今天BIOTREE技术支持部的小伙伴Clover通过Nature Plants上的Maize multi-omics reveal roles for autophagic recycling in proteome remodelling and lipid turnover一文给大家详细解读如何运用多组学联合分析阐述玉米自噬的影响。
 
1
研究方法
 
玉米生长对氮缺乏高度敏感,这是其主要的农业限制之一,因此本文作者利用氮胁迫研究玉米自噬的功效。在植物中,主要的自噬途径由一系列自噬相关(AUTOPHAGY-RELATED,ATG)蛋白质介导,作者将野生型玉米(WT)和敲除核心自噬组分ATG12的突变体(atg12-1:完全敲除,atg12-2:中度敲除)在富氮(+N:15 mM)条件下培养2周,之后一部分继续培养,剩余的转至氮缺乏(-N:0.1mM)条件下培养,一周后取第二片和第四片叶进行各组学检测,代谢组和离子组分别设置5个重复,转录组和蛋白组分别设置3个,每个重复由5片相似的叶片混合而成。
 
代谢组学
 
2
研究结果
 
1.玉米atg12突变体对氮胁迫敏感
 
氮饥饿的玉米表现出强烈的生长抑制,但野生型尚未显示加速叶片衰老,而atg12突变体明显衰老。
 
代谢组学
图1.野生型及atg12突变体在+N/-N中的生长状态
 
氮胁迫改变了WT叶片的转录组和蛋白质组,氮代谢增加,叶绿素表达降低。atg12突变体在低氮条件下过早衰老,氮缺乏影响叶片的发育(叶长、叶绿素)。ATG8蛋白家族及总蛋白的丰度在atg12突变体中升高,表明自噬对于维持植物中正常的蛋白质丰度很重要,atg12突变体阻断ATG8自噬介导的转换。
 
除了离子组,不同生长条件的玉米代谢组、转录组和蛋白组都能很好的分开,表明氮饥饿和自噬都影响玉米代谢组、转录组和蛋白质组。
 
代谢组学
图2.atg12突变体对氮胁迫更敏感并且蛋白质含量升高。a.氮胁迫改变了WT叶片的转录组和蛋白质组。b.WT叶中GO功能的富集或消耗。c.atg12突变体在低氮条件下过早衰老。d.氮的有效性影响叶片的发育。e,f. atg12突变体第二叶中ATG8蛋白家族丰度升高。g,h.atg12-1和atg12-2中总蛋白水平升高。i.WT、atg12-1和atg12-2(+/- N)相应的代谢组、离子组、转录组和蛋白质组数据集的PCA。Met.:新陈代谢,Resp.:响应。
 
2.代谢组
 
自噬严重影响玉米代谢组,特别是对于脂质和次级产物。定性的417个代谢物中,在第二及第四片叶分别有218和204个显著差异(P≤0.05且FDR≤0.05)。代谢物水平在富氮植物中也发生明显差异,表明即使在正常生长条件下自噬也会显著影响玉米代谢;在氮饥饿时差异相对较小,特别是脂质,表明饥饿激活除自噬以外的其他分解代谢途径以帮助应对这种营养挑战。
 
代谢组学
图3.atg12突变体在富氮和饥饿条件下显著改变玉米代谢组
 
在atg12突变体中,许多完整磷脂、鞘脂和半乳糖脂减少,脂质分解产物累积增加,因此atg12可能与加速膜转换和脂解作用有关;次级代谢的相关化合物,如具有强抗氧化活性的丁香酸、芦丁和开环异落叶松树脂酚强烈增加,而苯环合成途径的中间体香草醛含量降低;抗氧化剂谷胱甘肽及其相关代谢物水平增加。这意味着突变植物试图通过合成广泛的抗氧化剂来抵消代谢挑战。
 
代谢组学
图4.a.基于代谢功能/途径的417个代谢物网络图。b.受atg12突变影响的脂质及分解中间体和次级代谢相关化合物的箱式图。
 
3.转录组
 
自噬严重影响玉米转录组,第二和第四片叶中分别有3,082、2,426个差异转录本(P≤0.05且FDR≤0.05)。567个核心转录本(至少在四个条件中的三个存在一致差异)中,与昼夜节律、非生物胁迫、叶绿体和水杨酸反应相关的在WT中显著富集,而蛋白酶活性和对锌的反应显著减少。在atg12叶中编码蛋白酶的mRNA的增加反映了在缺乏自噬的情况下可能激活了恢复氨基酸再循环的替代蛋白水解途径。脂质代谢没有作为重要的GO功能出现,但是编码许多脂肪酶的转录物显著上调。
 
代谢组学
图5.突变体在富氮和饥饿条件下显著改变玉米转录组。a.atg12-1和atg12-2突变同样影响玉米转录组。b.热图显示在+ N或-N中生长的WT与atg12突变体的差异转录本。c.维恩图显示atg12突变体与WT中差异一致的转录本数量。d.核心转录本的对应GO功能的富集/消耗。e.特定GO功能的代表性转录物受到atg12突变+/- N的影响。
 
4.离子组
 
常见元素定量分析结果显示atg12-1和atg12-2与野生型相比未能检测到强烈且一致的变化。铝、钠、铜、镁和硒,在氮缺乏的atg12植物的第二片叶子中略微超积累,这可能反映了自噬具有一定动员这些元素的作用。有趣的是磷,在atg12突变体中似乎加速了膜转换,然而,磷只在氮缺乏的atg12-1叶中显著增加。
 
代谢组学
图6.atg12突变体第2和第4片叶元素离子含量的细微差别。
 
5.蛋白组
 
自噬严重影响玉米蛋白质组,第二和第四片叶中分别有673、666个差异蛋白(P≤0.05且FDR≤0.05)。在atg12突变体中蛋白积累更多,在atg12-1中差异更大,与总蛋白质的SDS-PAGE分析一致。许多“细胞组分”和“生物过程”相关蛋白在atg12中显著过表达,包括与过氧化物酶体、ER和胞质溶液相关的蛋白质组,和/或涉及小分子,羧酸盐、脂肪酸、苯丙烷和葡萄糖代谢的蛋白质,其中一些被预测为自噬靶标和/或之前已经证明在atg12突变下含量升高,类囊体和光合作用相关蛋白在突变体中降低,这可能与叶片早衰有关。
 
代谢组学
图7.突变体在富氮和饥饿条件下显著改变玉米蛋白组。a.atg12-1和atg12-2突变体同样影响玉米蛋白质组。b.热图显示在+ N或-N中生长的WT与atg12突变体的差异蛋白。c.火山图显示atg12-1与WT叶中单个蛋白质的优先积累。d、e.图c中差异蛋白的特定GO功能的富集/消耗,d.“细胞成分”的富集。e.“生物过程”的富集。Cat.:分解代谢。
 
过氧化物酶体、内质网、蛋白酶体、苯丙烷代谢与脂肪酸代谢相关蛋白在atg12突变体中升高,类囊体在atg12-1突变体中降低,而氮饥饿能够促进这些积累,因此这些区室/过程可能是自噬底物。
 
代谢组学
图8.atg12突变对玉米叶片中细胞区室、代谢过程和蛋白质复合物的影响。a、c.火山图显示atg12-1与WT叶中特定区室、代谢过程或蛋白质复合物的相关蛋白质的优先积累。b、d.特定GO功能中的代表性蛋白质丰度变化。
 
6.蛋白、转录与代谢关联分析
 
atg12-1突变体中差异蛋白大部分仅丰度发生显著变化,相应的mRNA未变化,表明突变体中大多数蛋白质的增加受自噬影响,而与合成无关(即转录和/或翻译)。苯丙烷类和氨基酸代谢相关蛋白和mRNA都升高,表明这些蛋白质水平的升高至少部分地由合成升高引起,这与这些途径相关的代谢物水平的变化相一致。内膜、过氧化物酶体、高尔基体、胞质溶胶、内质网、蛋白酶体和与脂肪酸和蛋白质分解代谢相关的蛋白质水平升高,但是相应的mRNA未增加,这可能是自噬清除的抑制引起,而不是由增加合成引起的。突变体中类囊体的消耗再次与atg12植物中叶绿体的加速分解一致,这可能是没有自噬的情况下其他分解代谢途径的驱使。
 
atg12突变体诱导的脂质代谢相关的主要mRNA和蛋白质水平的代谢物的改变一致。atg12叶片中脂肪酸水平积累,这与通过β-氧化参与脂肪酸分解的过氧化物酶体变化趋势相同,认为过度累积的过氧化物酶体是功能障碍的隔室,等待自噬清除,因此不能胜任代谢脂肪酸的功能,暗示突变体中脂肪酸和脂质分解产物的过度积累是由自噬调节的其他分解代谢过程缺陷引起的;atg12脂肪酸的积累与脂肪酸β-氧化途径中相关蛋白增加(相应mRNA未增加)的现象相脱节,这或者与蛋白清除相关。与之相反,苯丙烷代谢、类黄酮代谢和花青素代谢途径中间产物水平与蛋白酶及相应mRNA一致。
 
代谢组学
图9.转录组和蛋白质组比较鉴定了受转录和/或自噬影响的过程。a.散点图显示了atg12-1与WT的蛋白质和mRNA丰度变化之间的关系。b.图a中有色区域对应的主要GO功能。c.散点图显示atg12-1与WT植物中特定GO功能对应的转录物和蛋白质的相对丰度间的相关性。d、e、f、g.简化的代谢流程图描述了在高氮条件下第二片叶子中atg12-1与WT的代谢物、相关蛋白及其相应mRNA的变化。e.脂质代谢主要途径的流程图。f.脂肪酸分解代谢的β-氧化途径流程图。g.苯丙烷、木脂素、类黄酮和花青素合成路线的组合流程图。没有颜色/没有值的隔室表示未检测到的代谢物/ mRNA /蛋白质。
 
7.RT-PCR
 
参与脂质代谢的蛋白质、颗粒蛋白半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸羧肽酶、过氧化物酶体PEX14、线粒体VDAC蛋白编码的许多mRNA的RT-qPCR结果证实了atg12突变对转录物丰度的影响。免疫印迹分析证实PEX14、VDAC和ER定位的ACA2在atg12-1背景中更丰富,因此可能是自噬靶标,类似已知的自噬调控者或靶标:ATG8、NBR1自噬受体和蛋白酶体亚基PBA1和RPT4。有趣的是,所有这些蛋白质在低氮条件下生长的叶片中含量较少,这意味着它们在氮饥饿时会加速其自噬转换。
 
代谢组学
图10.定量RT-PCR和免疫印迹分析证实了几种转录物丰度的明显变化和atg12突变体中细胞器特异性蛋白质的积累。a.特定转录物的表达变化。b.特定蛋白的丰度变化。
 
3
总结与讨论
 
1.富氮和氮缺乏条件下,自噬都改变了玉米转录组和蛋白质组,并且强烈地改变了叶片代谢,特别是在脂质分解以及次级产物的积累方面。atg12突变体仅在氮饥饿时引起视觉症状。
 
2.玉米第二片叶可能反映出更强大的自噬系统,这些系统准备重新调节营养物质以支持新的生长,并在其衰老时有效地分解代谢。
 
3.证实了自噬清除过氧化物酶体、线粒体、核糖体和蛋白酶体,并指出了降解ER和高尔基体的可能作用。
 
4.该研究为多组学在植物中的运用提供了参考,同时也为研究植物的自噬过程提供依据。
 
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