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文献分享 | HSFB2b通过促进类黄酮生物合成赋予大豆耐盐能力

分类:
阿趣动态
发布时间:
2019/10/16 11:39
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我国大豆的产量远远不能满足国内需求,提高大豆的耐逆性可以充分利用边际土地增加大豆种植面积从而提高大豆产量。热激转录因子基因在植物生长过程中发挥了重要作用,然而在大豆耐盐反应中热激转录因子的功能及机理仍不清楚。
 
本期文献:
 
A class B heat shock factor selected for during soybean domestication contributes to salt tolerance by promoting flavonoid biosynthesis. IF=7.430
 
(文末有原文下载链接)
 
文献作者从103份野生大豆资源中筛选得到2份耐盐性强的野生大豆资源,通过RNA-Seq差异表达基因和共表达网络分析得到参与大豆盐胁迫反应的B类转录因子基因HSFB2b。在大豆转基因毛状根体系和稳定的转基因大豆中过表达HSFB2b均可以提高大豆的耐盐性。进一步研究发现HSFB2b可以直接激活黄酮类化合物合成途径,同时解除另一个转录因子GmNAC2的抑制作用,从而促进黄酮类化合物的合成,降低体内ROS的积累以提高大豆的耐盐性。
 
图:HSFB2b的工作模型
 
图1
盐胁迫下野生大豆hub转录因子基因的鉴定及HSFB2b在转基因大豆毛状根耐盐性中的作用。
 
用1.5%NaCl筛选103份野生大豆材料,鉴定出2份耐盐野生大豆y20和y55,发芽率高。再用1%NaCl处理后,三种材料的生长都受到抑制(图1a)。然而,两个耐盐品种y20和y55在处理后的存活率显著高于盐敏感品种y0532(图1b)。Y20和Y55中反映细胞膜损伤的相对电解质渗漏也显著低于Y0532(图1C)。这些结果表明y20和y55比y0532更耐盐。
 
为了确定这些野生大豆对盐胁迫差异反应的潜在基因,将3周龄的幼苗置于150 mM NaCl处理0、3、6和12 h,然后收集根进行转录组测序。与相应的“0”点相比至少在一个时间点显示2倍差异(fdr<0.05)的基因被视为总差异表达基因(degs)。在这些差异表达的基因中,选择在两种耐盐材料(y20和y55)中表达量均高于盐敏感材料y0532的转录因子基因作为诱饵,对总差异表达基因进行共表达网络分析(图1d)。利用转基因大豆毛状根系统检测上调的hub转录因子基因(图1d)在盐胁迫耐受中的功能。在这些被检测的基因中,只有编码b型热休克因子(hsf)的glyma.11g025700表现出一致的耐盐表型。来自glyma.11g025700位点的编码蛋白与拟南芥HSFB2b(图1e)聚簇,因此命名为HSFB2b以供进一步研究。
 
研究了盐胁迫对大豆HSFB2b表达的影响。在叶和根中均高度诱导,耐盐Y55和Y20的诱导水平高于盐敏感Y0532、HSFB2b在根和其他大豆器官中表达轻微,但在种子发育的中期,在h5种子中高表达(图1f-h)。并且HSFB2b在转基因毛状根中的过表达可以提高大豆的耐盐性(图1i-l)。
 
图2
盐胁迫下野生大豆hub转录因子基因的鉴定及HSFB2b在转基因大豆毛状根耐盐性中的作用。
 
作者用双荧光素酶报告法测定了拟南芥原生质体中HSFB2b的转录调控活性。显示HSFB2b具有转录抑制活性(图2a)。为鉴定HSFB2b的靶基因,采用35s-HSFB2b-gfp转基因毛状根,用抗gfp抗体进行染色质免疫沉淀测序(chip-seq)。以35s-gfp转基因毛状根为阴性对照。35s-HSFB2b-gfp毛状根的芯片信号富集度高2.5倍,表明hsp2b与gmnac2启动子区有关(图2c)。然后,对HSFB2b转基因毛状根中gmnac2的转录水平进行了分析。与k599根相比,HSFB2b毛状根中gmnac2表达下调,而hsfb2b rnai毛状根中gmnac2表达上调,表明HSFB2b抑制gmnac2表达(图2d)。通过进一步分析gmnac2启动子,发现了三个hsf结合元件(ngaannttcn),其中一个位于芯片qpcr产品中。凝胶移位试验表明HSF2Bb直接结合到GMNAC2启动子(图2E)。烟草中瞬时表达分析显示HSFB2b抑制了GMNAC2的启动子活性(图2F,2G)。这些结果表明HSFB2b通过直接与启动子结合抑制gmnac2的表达。由于HSFB2b的过表达增强了毛状根的耐盐性,HSFB2b直接调节gmnac2的表达,作者用上调或下调的gmnac2。经过nacl处理后,转基因毛状根的生长速度比转k599或gmnac2 rnai基因的根慢,伸长小(图2I,2J)。与对照相比,含gmnac2-oe根的大豆植株叶片表现出明显的黄化现象。结果表明,gmnac2对大豆毛状根的耐盐性具有负调控作用。同时高表达HSFB2b和gmnac2的转基因毛状根,转基因毛状根在盐胁迫下表现出与gmnac2 oe转基因毛状根相似的表型,而hsfb2boe转基因毛状根在盐胁迫下表现良好(图2l)。HSFB2b-和gmnac2过表达转基因毛状根的大豆植株叶片表现出明显的叶片失绿,这与gmnac2-oe根植株的叶片失绿相似(图2m)。相对电解质泄漏水平也显示出一致的变化(图2n)。这些结果表明,gmnac2基因在盐胁迫调控中起着HSFB2b下游的作用。
 
图3
HSFB2b转基因大豆黄酮合成相关基因表达上调。
 
对转基因处理的OE-26组和JACK组的degs进行基因本体(GO)和KEGG通路分析。GO分析表明,参与刺激反应和苯丙酸代谢的基因高度富集。KEGG数据显示,参与类黄酮生物合成的基因在叶和根中都很丰富(图3a)。这表明HSFB2b可能通过影响苯丙酸和类黄酮的生物合成来调节盐胁迫。
 
然后作者检测了在HSFB2b过度表达的大豆植株中类黄酮生物合成相关基因的表达。在HSFB2b转基因大豆中,类黄酮生物合成的其他调节因子(r2r3myb/bhlh同源基因)被上调,HSFB2B在烟叶分析中激活了GMC4H和GMCHS3的启动子活性(图3d,3f)。因此,HSFB2b可能直接激活黄酮生物合成中gmc4h和gmchs3的表达。
 
采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)法进一步测定了膨大叶片、根系和种子中黄酮类化合物的含量。使用40 mg粉末样品,采用高效液相色谱-质谱法测定黄酮类化合物。采用安捷伦1290无限长液相色谱仪和6550电喷雾四极飞行时间串联质谱仪组成的uhplc-ms/ms系统对提取物进行分析。
 
分析了叶片中的23种黄酮成分和根和种子中的20种成分。HSFB2b转基因大豆的叶、根和种子中总黄酮含量显著增加(图3h)
 
综上所述,HSFB2b高表达大豆促进了黄酮类化合物的生物合成。黄酮类化合物可能参与了HSFB2b转基因大豆的耐盐性。为了研究黄酮类化合物在盐胁迫下的作用,作者将黄酮类化合物合成的中间产物槲皮素应用于大豆幼苗。盐胁迫处理后,对照植株出现叶片失绿,而槲皮素处理的植株表现出比模拟植株更好的表现(图3i,3j)。
 
图4
gmnac2抑制gmchs1、gmchs4、gmfls1和gmfls2的表达。
 
作者检测了在HSFB2b过度表达的大豆植株中gmnac2的转录水平。在HSFB2b过度表达的幼苗中,gmnac2的表达显著下调(图4a)。为了了解gmnac2与类黄酮生物合成的关系,对转基因毛状根中类黄酮生物合成相关基因的表达进行了检测。作者发现在高表达gmnac2的毛状根中类黄酮生物合成相关基因的表达减少(图4b)。同时,芯片qpcr分析显示gmnac2最有可能与gmchs1、gmchs4、gmfls1和gmfls2的启动子结合,因为芯片信号在35s-gmnac2-gfp转基因毛状根中比在35s-gfp根中丰富(图4c)。此外,GMNAC2在烟叶分析中抑制了这些基因的启动子活性(图4d,4e)。这些结果表明HSFB2b抑制gmnac2的表达,释放类黄酮生物合成,具有抗盐胁迫作用。
 
图5
大豆驯化过程中选择的与耐盐性相关的HSFB2b启动子单倍型。
 
在HSFB2b启动子区鉴定出4个单倍型,并且从野生大豆添加y20中挑选出的单倍型ii显然是在驯化过程中用于栽培大豆的耐盐性和/或种子性状(图5)。使用KF(具有单倍型IV)和NN(具有单倍型II)之间的交叉衍生的RIL群体进行关联分析进一步支持具有单倍型II启动子的HSFB2b与耐盐性相关的建议(图5g)。单倍型ii启动子的变异可能为盐胁迫下HSFB2b基因的诱导提供了新的蛋白质组合和连接,从而使大豆具有更好的适应性生长。值得一提的是,单体型Ⅱ型HSFB2b启动子在中国东北地区到黄淮海地区的栽培大豆品种中广泛存在,这可能是由于选择的缘故,尽管黄淮海地区的一些省份的大豆品种可能仍然存在。通过引入单倍型进行改进ii HSFB2b启动子。值得注意的是,野生大豆y55的iii型HSFB2b启动子在盐胁迫下具有最高的启动子活性,可能具有更好的耐盐性,但在栽培大豆中的分布频率仍然很低。这种罕见的iii型HSFB2b启动子可作为驯化过程中下一波选择的靶点。通过育种将这种罕见的单倍型引入大豆品种,可以进一步提高大豆在盐胁迫下的表现,从而在不利条件下获得较好的产量。
 
结论
 
总之,作者从野生大豆中鉴定出一种b型热休克因子HSFB2b,该蛋白通过直接和/或间接促进类黄酮生物合成而赋予大豆耐盐能力。在驯化过程中选择了HSFB2b基因的Ⅱ型启动子,盐胁迫下活性最高的稀有Ⅲ型HSFB2b启动子可能是下一轮大豆育种选择的目标。
 
类黄酮化合物(Flavonoids)主要指具有2-苯基色原酮(2-Phenylchromone)母核结构的一类化合物的总称,是植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物,广泛存在于高等植物的根、茎、叶、花及果实中。黄酮类化合物具有多种重要的生理、生化作用,对人类疾病有着重要防治价值,如减少癌症、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗衰老、抗骨质疏松、抗病毒、抗炎症等。Biotree类黄酮广泛靶标产品共可以检测86+黄酮类物质,已有标准品,可以做广靶及靶标检测。欢迎了解哟~
 
文献下载链接: https://pan.baidu.com/s/1NzcaKmz3iyTvSq-7IB55WA
 
提取码: daq4
 
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