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文献分享 | 缺氧或可通过改变肠道微生物群诱导骨髓间充质干细胞衰老

分类:行业资讯   发布时间 2020-06-22   阅读: 44

代谢组学


阜外医院:Xing J, Ying Y, Mao C, et al. Hypoxia induces senescence of bone marrow mesenchymal stem cells via altered gut microbiota. Nature Communications 2018; 9(1): 2020. IF=12.353
课题方向:缺氧-肠道菌群-骨髓间充质干细胞的衰老
组学平台:GC-TOF/MS(骨髓上清);16s(粪便);宏基因组(粪便);分子生物学(WB/MTT等)
分组情况:non-CCHD (NCy);CCHD (Cy) 
分析图:气泡图等

系统性慢性缺氧是一种与全身供氧不足相关的病理状态,是许多疾病的特征。紫绀型先天性心脏病(CCHD)、慢性阻塞性疾病等许多疾病患者都会经历慢性缺氧过程。CCHD患者表现骨髓间充质干细胞(BMSCs)过早衰老和D-半乳糖(D-galactose)异常积聚。

越来越多的证据表明肠道与骨髓(BM)之间存在通讯。慢性深度缺氧可以改变肠道微生物群的多样性,并导致肠道微生物群衍生的代谢物的积累,这可能显著影响宿主的体内平衡。作者采集了90名接受开胸心脏手术的幼儿患者【NCy(non-CCHD),Cy(CCHD),样本具体信息见表1】胸骨骨髓和肠道粪便样本,通过常规基础实验、16SrDNA测序、宏基因组测序、代谢组学检测和动物模型试验来研究慢性缺氧与骨髓及肠道微生物群的关系。
          
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表1 样本信息

1 CCHD患者的缺氧及早衰情况研究

1.1 血气分析

与NCy组相比,Cy组骨髓与外周动脉血的氧分压与氧饱和度均显著降低(表2)。
       
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表2 外周动脉与骨髓血气分析

1.2 CCHD患者的BMSCs出现早衰

Cy组与NCy组的BMSCs分离培养(n = 5 每组)后分别进行western blot analysis、MTT assay、SA-β-gal analysis、及FACS analysis。结果发现Cy组中早衰标记蛋白(p16)表达量显著升高(Fig. 1a);活细胞数显著降低(Fig. 1a),表明细胞生长更缓慢;半乳糖苷酶阳性细胞数显著增多(Fig. 1c);处于G0和G1期的细胞明显增多,而S与G2/M期细胞减少 (Fig. 1d)。

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图1 来自CCHD患者的BMSCs易于过早衰老

2 代谢组学研究

通过GC-TOF/MS平台对Cy与NCy组中BM进行代谢组学研究(n = 20 每组),发现严重缺氧改变了BM的代谢谱。CCHD(Cy)患者与对照组(NCy)的差异代谢物主要富集在糖酵解、糖异生、TCA循环和半乳糖代谢途径(Fig. 2a),这些途径分别涉及糖代谢和氨基酸代谢;D-半乳糖可以通过产生大量活性氧(ROS)来诱导衰老,经检测发现CCHD患者外周血(n = 22 每组)和骨髓(n = 5 每组)的半乳糖含量增加(Fig. 2b),同时BMSCs中ROS升高(Fig. 2c)。

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图2 深度缺氧改变了骨髓代谢

3 半乳糖和氧条件控制下培养的BMSCs早衰情况的研究

分离NCy组的BMSCs,用不同氧条件(Hypo-:4% or Nor-:21%)与D-半乳糖浓度(N-:50 μg/ml or H-:90 μg/ml)进行培养后分别进行western blot analysis、MTT assay、SA-β-gal analysis、ROS 检测以及FACS analysis。与其他3组相比,Hypo-H-Gal 组中早衰标记蛋白(p16)表达量明显增加(Fig. 3a) ,细胞增长显著降低(Fig. 4b),半乳糖苷酶阳性细胞数显著增多(Fig. 3c),ROS显著增加(Fig. 3e),更多细胞处于G0和G1期(Fig. 3d),表明低氧和过量半乳糖同时出现可导致BMSCs早衰。

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图3 D-半乳糖的累积和缺氧导致BMSCs早衰

4 肠菌16SrDNA与宏基因组测序

通过对受试者的粪便进行16SrDNA与宏基因组测序(n = 20 每组),发现CCHD患者肠道菌群中乳杆菌、肠杆菌科、毛螺菌属、疣微菌科、粪杆菌属等含量减少(Fig. 4f);3种半乳糖降解酶【lactase (LCT), aldose 1-epimerase, GALE (UDP-glucose 4- epimerase)】含量显著降低(Fig. 4g);同时粪便中乳杆菌含量与血液中半乳糖含量成负相关(Fig. 4h)。

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图4 深度缺氧导致肠道微生物群紊乱

5 缺氧与乳酸菌对BMSCs的影响

5.1缺氧大鼠BMSCs早衰情况

新生Sprague-Dawley 大鼠随机分成低氧组(Hypoxia)与对照组(Normal)(n = 9 每组),分别于10% O2或正常空气中饲养3周,并进行血液半乳糖含量与粪便乳酸菌水平测定、早衰标记蛋白与肝脏中半乳糖代谢相关酶的western blot analysis。结果表明缺氧导致大鼠半乳糖含量显著升高(Fig. 5a),乳酸菌含量显著降低(Fig. 5b),早衰标记蛋白(p16)表达量显著升高(Fig. 5c),半乳糖降解酶(GALK1)表达量显著降低(Fig. 5d),这与CCHD样本的检测结果一致。

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图5 大鼠慢性缺氧模型中D-半乳糖累积和BMSCs功能障碍

5.2 乳酸菌缓解BMSCs缺陷

新生雄性Sprague-Dawley 大鼠随机分成4组(n = 9 每组),其中2组(Hypoxia)于10% O2空气中饲养3周,而另2组(Normal)于正常空气中饲养3周,并在最后一周对低氧与正常氧中各1组每天灌胃乳酸菌:Lactobacillus casei CRL431(+),另1组灌胃盐水(-),之后分别进行早衰标记蛋白的western blot analysis、粪便乳酸菌的real-time qPCR analysis、半乳糖含量及肠道乳糖酶(LCT)活性的测定、肠组织H&E 染色、MTT assay、SA-β-gal analysis、以及FACS analysis。无论正常饲养还是缺氧饲养,灌服乳酸菌的大鼠粪便样本中乳酸菌含量增加(Fig. 6a) ,外周血中半乳糖含量降低(Fig. 6b),G0和G1期细胞减少(Fig. 6h);相对于缺氧未灌服乳酸菌组,灌服乳酸菌组活细胞数增加,半乳糖苷酶阳性细胞数明显降低(Fig. 6g),早衰标记蛋白(p16)表达量明显降低(Fig. 6e);LCT活性在4组中未发生明显变化(Fig. 6d);缺氧导致肠绒毛萎缩,补充乳酸菌后未有改善(Fig. 6c)。肠道微生物群落的改变可能是BMSCs缺陷的主要原因。而补充乳酸菌可缓解大鼠BMSCs衰老、细胞不良增殖以及细胞周期阻滞。

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图6 大鼠缺氧模型中通过补充乳酸杆菌恢复缺乏的BMSCs功能

结论:
1. CCHD患者所经历的慢性深度缺氧会对骨髓基质干细胞产生不良影响;
2. CCHD患者经历的缺氧导致肠道微生物群落的多样性改变,乳杆菌数量显著减少,降解D-半乳糖的酶减少;
3. 血液和BM中过量的D-半乳糖通过ROS的累积可诱导BMSCs过早衰老;
4. 在大鼠模型中补充乳酸杆菌可以降低D-半乳糖积累、恢复缺氧大鼠模型中缺乏的BMSCs的功能。

参考文献:
Xing J, Ying Y, Mao C, et al. Hypoxia induces senescence of bone marrow mesenchymal stem cells via altered gut microbiota. Nat Commun 2018; 9(1): 2020.

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