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文献分享 | 样本冻融对代谢组学的影响

分类:行业资讯   发布时间 2020-06-28   阅读: 48

Translation of differences in the metabolomes into the phenotypic difference of the samples — Metabolomics

代谢组学的样本收集及保存有很多需要注意的点,比如样本分装,低温保存,不可冻融,血液样本不能溶血等等,今天要给大家分享的文章是血清样本冻融之后的代谢影响。

代谢组学
血清血浆是代谢组学中很常见的样本,当样本没有分装的时候很容易出现解冻后再冻存的情况,因此研究冻融是否对代谢组学检测有影响就很重要。

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实验设计

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图1. 实验设计


如上图所示,作者选取了99个健康人的血清样本,研究不同冻融次数(FTC)的影响。样本保存于-80℃中,解冻的过程为在室温下放置90分钟使其完全解冻。第一次解冻结束后,每个样本取出30μl作为FTC 1(F1)的样本,将剩余的样本重新放入-80℃冰箱保存。以上过程重复5次,即得到不同冻融次数的样本F2-F5。

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结果

5次冻融实验共得到495个样本,将组内检测率大于80%的peak保留,共检测到2334个代谢物(本文中代谢物鉴定方法为three-tier approach)。

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多变量单变量分析

如下图A所示,PCA分析中QC聚集的很好,可以说明仪器的稳定性很好。(大家可以看到QC在PCA的95%置信区间外,因此QC虽然是样本的混合,会有向各组中心趋近的可能,但是不代表这样的趋近一定是线性的,PCA展示的是多维空间的二维投影,在投影过程中产生偏离是十分正常的情况。)


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图2. 5组样本+QC的PCA图

下图A为五组样本无QC的PCA得分图,图B为五组样本的PLS-DA得分图。在PCA图中组间差异不明显但是有监督的PLS-DA可以将组间差异清晰的展示出来,F1 (1次冻融) 和F2(2次冻融)与其他组有明显的区分,图B的置换检验结果也说明模型可靠。

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图3. 5组样本的PCA图


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图4. 5组样本的PLS-DA图及其置换检验结果

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单变量统计分析

作者使用p值和差异倍数(FC)作为差异物筛选的条件,p<0.05为具有显著差异,选择不同的FC倍数:1.2, 1.3, 1.4, 1.5为差异物筛选规则,筛选结果如下表1所示,我们可以看到F3, F4, F5比较筛选出的物质较少,所以这三组之间差异较小,与上面的多元统计分析一致,表明在冻融两次之后,冻融对代谢物的影响变小。

另外,每次冻融都会导致代谢物发生变化,但是通过对这些物质的分析发现这些差异物之间没有交集,那么我们无法预测冻融可能会对哪类物质产生显著影响,因此若使用冻融样本筛选出的差异物中很可能包括冻融导致的差异物。另外,根据不同的FC筛选出的物质数量及种类都不同,但是FC越大差异物越少,因此筛选规则中较小的FC会引入更高的假阳性。

表1. 两两对比的差异物筛选结果
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然后,作者分析了代谢物的浓度是否会随着冻融次数有相同的改变模式。下图A中展示了F2-F4与F1的比较中变化超过了50%的72个物质,很明显这些物质的浓度并没有随着冻融次数的增加而逐渐变化,大部分物质的变化都是不规律的。如下图B 的箱线图所示,代谢物可以逐渐增加也可以逐渐减少,或者无规律的变化。因此,冻融对代谢物的影响是不同的。但是这种改变模式的原因是未知的,逐渐降低趋势的原因可能是在冻融过程中发生了降解,逐渐升高趋势的原因可能是冻融导致蛋白表面的物质被释放或者由其他物质转换而来,无规律变化模式的原因可能有多种影响因素。

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图5. 72个物质在5组中的热图

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图6. 不同差异物在五组中的变化模式

总的来说,作者发现冻融对血清代谢组学的影响很大,虽然在FC≥1.5的时候筛选出的差异物较少但是这也会为标志物的发现带来很大的挑战,尤其是当生物表型差异不会引起很大的代谢组学变化的时候,如下面要分析的性别因素。

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性别差异分析

本文中的样本都来自健康人,其中最大的差别就是性别,99个样本中包括47位男性和52位女性。下图C,D展示了按性别分组后2D和3D的PLS-DA得分图,在每个组中的男性和女性都有明显的区分,尤其是F 1组中,这表明在有冻融效应的情况下性别区分依然存在,但是冻融效应可能会干扰性别相关标志物的发现。作者考虑了两种在生物标志物发现过程中可能存在的情况。第一种是所有的样本使用相同的冻融次数,第二种是样本使用不同的冻融次数。

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图7. 5组样本按照性别分组后的2D, 3D-PLS-DA图

对于第一种情况,作者使用两两比较的方法去分析数据。表2列出了以FC≥1.5和p<0.05筛选出的差异物,可以看到当冻融次数增加时,男性-女性之间的差异物数量并没有显著增加,这表明冻融效应不偏向男性或女性。

表2. 不同冻融次数的两两对比差异物筛选
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在不同性别-相同冻融次数的5次比较中,有11个物质是一直存在的,可以被看作性别区分的标志物,如下图所示。No.238和No.473是11个物质中区分性别最显著的物质,但是没有被准确鉴定出来(鉴定方法为three-tier approach)。No.238可被认为是GABA的同分异构体(二级鉴定),No.473可被匹配为肌肽的衍生物(三级鉴定),有研究表明GABA和肌肽在男性中的含量比女性中的高,与本文的研究一致。

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图8. 11个差异物在男性-女性组中的变化箱线图

作者使用随机森林的方法检测这两个标志物在F1组中的区分能力,结果如下图所示,AUC的面积为0.978,然后应用于F2-F5组中,区分准确度随着冻融次数保持稳定,因此冻融效应并不影响相同冻融次数的标志物发现,图C, D中看到这两个物质的浓度是相似的,因此无论冻融次数是多少都可以发现这两个性别区分标志物。

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图9. 性别标志物在F1组中的ROC分析(A)及其他组性别区分的准确度(B)。No.473(C)和No.238(D)在组件的浓度变化箱线图

第二种情况中样本使用不同冻融次数的情况是比较常见的,尤其是当大样本量研究需要分为几个batch的时候。下表展示了不同冻融次数的组间比较结果,结果表明当两组样本用不同的冻融次数处理时冻融效应会有明显的增强。

表3. 不同冻融次数的两两对比差异物筛选
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作者分析了在不同冻融次数的组中发生显著变化的差异物。下图A展示了No.1286的变化, F1中男性组的浓度高于女性组,当男性组和女性组样本经历了相同的冻融次数,男性组中物质浓度都相应的增高,男女差异一直都存在。但是当比较F1-M和F2-F的时候差异很明显的减小了,我们使用FC≥1.5去筛选性别标志物这个物质就被漏掉了,导致假阴性。另一方面,当F1-F和F2-M一起分析的时候,性别差异就会被放大,这种情况可能会导致结果的假阳性。因为我们无法预测代谢物在冻融时的变化模式,因此我们没办法发现标志物筛选过程中出现的假阳性和假阴性。

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图10. No.1286在不同组间的浓度变化箱线图

在标志物发现的过程中,假阳性会导致错误的标志候选物,假阴性会减小真正的标志物发现的机会。当样本被分为不同的batch后,冻融次数是一个必须要考虑的因素。如果生物表型差异和冻融效应相似时(下图B),冻融次数就会导致假阳性或假阴性的结果,但是当生物表型差异远大于冻融效应时(下图C),真正的差异物仍然可以被发现。

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图11. 冻融效应和相对弱(B)/ 强(C)的表型效应之间相互作用的示意图

在我们的研究中,真实情况远远比上述两种情况要复杂,关键的问题在于我们如何检测冻融效应是否会对发现标志物有显著影响。作者提供了一个检测冻融效应的方法,但是增加了很多工作量及时间,感兴趣的各位可以看看附件。

那么,我们从这篇文章中可以学习到什么呢?

1.虽然文章中用到的是血清,但是我们已经知道冻融是会对代谢物有影响的,因此代谢组学的所有样本在保存期间都要避免反复冻融,可将样本分装在离心管或其他容器中;

2.如果代谢物提取方法为冻融法,则需要确定冻融次数以保证尽可能多的提取出代谢物,因为文章中冻融5次后仍然可以提取出代谢物,那么样本中可能还有未被提取的物质;

3.冻融法提取代谢物时不同batch或者group的样本需要使用相同的冻融次数(小编觉得大家肯定都不会这么做的哈哈哈);

4.如果大家不太清楚哪些样本需要注意哪些点,可以联系BIOTREE的驻地工程师或公众号后台留言:“样本+姓名+单位+电话”索取代谢组学样本收集参考方法。

参考文献:
Deying Chen, Wei Han, Huan Tao, et al. Effects of Freeze-Thaw Cycles of Blood Samples on High-Coverage Quantitative Metabolomics.Analytical Chemistry. 2020 Jun 15. 

文献下载:
链接:https://pan.baidu.com/s/1IGBv9Et1DZtpt51o4YVX8Q

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