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样本收集手册 | 微生物、微生物培养基的收集方法及注意事项

分类:公司动态   发布时间 2021-04-08   阅读: 281

小伙伴们,我们代谢组学样本收集方法系列推文迎来了第四篇——微生物、微生物培养基的收集方法。近年来,微生物及其生长环境在代谢组学中的科学研究愈加频繁,活跃在科研人的眼前。相信从前面介绍的内容中科研小伙伴们一定对代谢组学样本收集有了一些整体概念,接下来让我们一起来看看微生物、微生物培养基的收集方法,加深下理解,let's go!!!

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微生物收集方法

细胞数量: 
需要细菌的数量为 1*107 cells(此为一次实验的用量,最好收集两次实验的用量,分两个离心管存放)。

取样时间:
细菌生长指数中期(mid-log) 

适用菌属: 
大肠杆菌(E.coli)[1,2] 

取样步骤:
1. 对细菌进行计数,计算1*107个菌体所需要的培养液的体积,记录为1体积; 
2. 快速收集1体积细菌培养液,并迅速在4℃条件下离心(1000 g, 10min)使细菌与培养液分离; 
3. 除去上清培养液, 将细菌快速浸入液氮中进行淬灭,30s; 
4. 淬灭后在冰上解冻,用1体积PBS 缓冲液(需预冷)洗去残留的培养液,然后离心(1000 g,4℃, 10min)尽可能将全部的 PBS 缓冲液去除; 
5. 保存在-80℃冰箱中。

适用菌属:
酵母菌及非丝状真菌 [3] 

取样步骤: 
1. 对细菌进行计数,计算1*107个菌体所需要的培养液的体积,记录为1体积;
2. -20℃下预冷淬灭溶液(甘油盐溶液,pure glycerol and sodium chloride solution (13.5 g/L) to a final ratio of 3:2 (v/v)),准备4体积; 
3. 迅速转移1体积细菌培养液至上述4体积淬灭溶液中; 
4. 快速摇匀溶液后,放入冰水浴中约5min; 
5. 使用冷冻离心机,-20℃条件下离心(36086 g,20min); 
6. 尽可能将全部上清移除,保存于-80℃冰箱中。

注意事项:
1. 寄送样本时请放入足量的干冰以保持低温条件(根据过往项目经验:快递途中干冰消耗率约为 5KG/天,消耗速度与气温,泡沫箱厚度(>5cm)有直接关系,请酌情添加干冰); 
2. 微生物代谢速度非常快,因此所有的步骤需要尽快完成;
3. 不同样本收集的微生物数量应一致。 

收集方法参考文献:
[1] Bertini I, Hu X, Luchinat C. Global metabolomics characterization of bacteria: pre-analytical treatments and profiling [J]. Metabolomics, 2014, 10(2):241-249. 
[2] Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69. 
[3] Kathleen F Smart, Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography– mass spectrometry, Nature protocols | VOL.5 NO.10 | 2010.

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微生物培养基收集方法

样品量要求:
200ul/sample, 提供两份样本并分2个离心管存放(条件允许最好500ul/sample)

 样本收集步骤:
1. 将培养液摇匀,快速从培养瓶中取出一定量的培养液,4℃条件下离心(1000 g,10min); 
2. 移取上清 500ul 至新的离心管中, 迅速放入液氮中淬灭,30s; 
3. 淬灭后放入-80℃冰箱中保存。 

注意事项:
寄送样本时请放入足量的干冰以保持低温条件(根据过往项目经验:快递途中干冰消耗率约为 5KG/天,消耗速度与气温,泡沫箱厚度(>5cm)有直接关系,请酌情添加干冰)。

收集方法参考文献:
[1] Silas G.Villas-Boas, Extracellular metabolomics: A metabolic footprinting approach to assess Wber degradation in complex media ,Analytical biotechnology, 2005. 
[2] Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69. 
[3] Farhana R. Pinu, Analysis of Intracellular Metabolites from Microorganisms: Quenching and Extraction Protocols, Metabolites, 2017.

小伙伴们发现了吗?代谢组学样本收集还是有些小规律的。为了检测的准确性,样本量要足够;为避免引入误差和杂质,经手人要少;由于检测的是取样时样本的代谢物,所以样本一定要淬灭;最后为了避免反复冻融,强烈建议各位科研达人将样本进行分装。

最后按照惯例附上我司协助客户以微生物胞内、胞外为样本发表的部分文章,供各位老师参考查阅。

1. 福建农林大学: Le-Xing You, Dan-Mei Pan, Nian-Jia Chen, et al. Extracellular electron transfer of Enterobacter cloacae SgZ-5T via bimediators for the biorecovery of palladium as nanorods.  Environment International 123(2019)1-9. IF=7.297
2. 兰州大学:Dongmei Xu, Nian Wang, Marketta Rinne, et al. The bacterial community and metabolome dynamics and their interactions modulate fermentation process of whole crop corn silage prepared with or without inoculants. Microbial Biotechnology 2020. IF=5.328

3. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所:Miaomiao Li, Jinlong Song, Qingyun Ma, et al. Insight into the characteristics and new mechanism of nicosulfuron biodegradation by a Pseudomonas sp. LAM1902. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 2020, January 22;68(3). IF=3.571

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